作者：孙倩美 刘敬伟 陈向东
【关键词】 尿毒症
【摘要】 目的 本文采用甲基纤维素细胞培养的方法，分析尿毒症患者血清对小鼠骨髓红系祖细胞集落形成的影响，初步探讨红细胞生成抑制因子的存在。方法 选择12例尿毒症肾性贫血未透析患者为试验组，另选正常健康体检者12例为正常对照组，将实验组、正常对照组血清分别稀释成不同终浓度，采用甲基纤维素细胞培养的方法对小鼠骨髓细胞进行培养，对比不同浓度血清组红系集落形成单位（CFU-E）、红系爆式形成单位（BFU-E）的集落数。结果 在实验组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显著性（P＜0.05）。结论 尿毒症患者血清抑制小鼠骨髓红系祖细胞集落形成，随患者血清浓度的增加，抑制作用增强，具有剂量依赖性。
【关键词】 尿毒症；贫血；红系祖细胞；集落形成单位测定
【Abstract】 Objective To investigate the existence of the erythropoiesis inhibitors （EI）.Methods The present study included twelve undialyzed ESRD patients with anemia.The sera from the uremic patients were added to CFU-E and BFU-E culture in the concentrations ranging from 1.25% to 5%.In vitro CFU-E and BFU-E growth in the presence of sera from ESRD patients was compared with in the presence normal human subjects with the use of normal mice bone marrows.Results The effects of the sera from uremic patients on CFU-E and BFU-E colony growth in concentrations ranging from 1.25% to 5% were investigated to be dose-dependent.The effect increased with the concentrations increasing of the sera（P＜0.05）.There were not significant inhibitory effect on the CFU-E and BFU-E growth of mice bone marrow in vitro from sera of the normal subjects.Conclusion The erythropoiesis inhibitors exist in uremic sera which has a dose-dependent inhibitive effects on the growth CFU-E and BFU-E of normal mice bone marrow cells.
【Key words】 uremia;anemia;erythroid progenitor cell;colony-forming units assay
贫血是尿毒症常见的并发症之一，严重影响患者的生活质量和疾病的预后。红细胞生成素（EPO）缺乏是尿毒症贫血的主要原因，但应用人基因重组红细胞生成素（rHu-EPO）治疗仍有20%~30%左右的患者疗效不佳［1］。目前的研究显示，一些尿毒症患者血EPO浓度并不下降，而是正常甚至高于正常，提示尚有其他重要因子参与肾性贫血的机制［2，3］。有研究表明，尿毒症患者血清能抑制骨髓红系祖细胞生长，充分透析增加毒素的消除，可改善尿毒症的贫血、提高rHu-EPO的疗效，所以提出了尿毒症某些毒素可能是红细胞生成抑制因子。但不同的研究小组获得的实验结果也存在争议。因此，近年来有关尿毒症红细胞生成抑制因子是否存在又引起学者们的关注，但目前仍没有达成共识。本文通过观察尿毒症患者血清对小鼠骨髓红系祖细胞集落形成的影响，初步探讨红细胞生成抑制因子是否存在。
1 对象与方法
1.1 实验对象 选择12例尿毒症肾性贫血未透析患者为实验组，原发病为慢性肾炎8例、高血压肾动脉硬化2例、慢性肾盂肾炎2例，其中男5例，女7例。患者平均年龄（50±12）岁，Cr范围8.2~14.7mg/dl，BUN范围83~135mg/dl。入选病例均无慢性炎症（C-反应蛋白水平正常），无血液系统疾病或肿瘤，无铁缺乏（血清铁蛋白＞100ng/ml）。患者在实验前均无输血史，未使用过rHu-EPO、铁剂，实验前一个月未使用过ACEI。另选正常健康体检者12例设为对照组，男6例，女6例，平均年龄（48±14）岁。
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集与保存 实验组及对照组受试者均于清晨空腹抽取静脉血，室温静置30min后离心，分离血清，56℃加热灭活30min，-80℃冰箱保存备用。
1.2.2 小鼠骨髓细胞红系集落形成单位（CFU-E）、红系爆式形成单位（BFU-E）的培养 取8~10周Bal-c小鼠（均由军事医学科学院实验动物研究所提供）。小鼠击头处死，75%酒精浸泡20min。立即无菌取出双侧骨髓，用IMDM培养液冲出全部骨髓细胞，台盼蓝染色进行细胞计数，并用IMDM培养液调整细胞密度为1×105/0.2ml（活细胞率＞95%）。
1.2.3 培养体系和条件 2.7%甲基纤维素，IMDM培养液，10-4mol/L巯基乙醇，15%小牛血清，3%谷氨酰胺，EPO（2u/0.2ml），CSF（50ng/ml），IL-3（10ng/ml）。将混匀的体系分别加到两个30mm培养皿中，加盖后放入37℃、饱和湿度的5%CO2培养箱内。培养第3天，联苯胺染色后倒置显微镜下计数含8个以上染色阳性的细胞集落为CFU-E。培养第7天，计数含50个以上染色阳性的细胞集落为BFU-E。
1.2.4 实验方法 将实验组、对照组血清分别用IMDM培养液稀释成终浓度为0（用等量培养液代替血清，作为阴性对照）、1.25%、2.5%、5.0%，观察两组不同浓度血清对小鼠骨髓CFU-E、BFU-E集落生长的影响。
1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差（±s）表示。采用双因素方差分析，组内无显著性差异则用单因素方差分析、q检验进行数据处理。以P＜0.05表示有统计学差异。数据处理应用SPSS 11.5统计软件包进行。
2 结果
2.1 实验组、对照组受试者不同浓度血清对小鼠骨髓CFU-E集落生长的影响 见表1。培养第3天可见CFU-E集落生长。在实验组，与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓CFU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显著性；在对照组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各不同浓度血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E的集落数差异无显著性。
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