作者：胡海，冉宇靓，陈立钊，遇 珑，孙立新，杨治华
【摘要】 目的 研制抑制肺癌细胞功能性单抗，为治疗肺癌提供靶向治疗剂，并为分离获得肺癌相关的分子靶标打下基础。方法 从新鲜人肺癌组织分离肿瘤细胞免疫Bal b/c小鼠，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后接种于甲基纤维素，制备大容量功能性抗体库。采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等方法筛选鉴定抑制肿瘤细胞的功能性单抗。结果 本次融合共获得了1573株杂交瘤克隆，在能与肺癌细胞膜反应的314株克隆中，154株与正常肺组织不反应或低反应。功能性筛选发现41株单抗显著地抑制肺癌细胞增殖，24株能抑制肺癌细胞对Matrigel的侵袭，15株能抑制肺癌细胞与Collagen I的黏附，进一步实验验证了2株单抗能在体内抑制肺癌移植瘤的生长。结论 采用大容量功能性抗体库技术成功获得了多株具有抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗，其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力。
【关键词】 肺癌；抗体库；功能性单抗；靶向治疗
肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，在欧美等发达国家,其发病率在各种常见肿瘤中居首位[1]。我国亦是肺癌的高发国家，每年死于肺癌的人数超过40万，且有明显的逐年递增趋势。尽管近年来肺癌的治疗手段有了较大提高，但是患者的5年生存率仍低于15%[2]。近年来美国FDA批准Herceptin和Avastin等单抗靶向药物作为一线抗癌药方案用于乳腺癌和转移性结肠癌的治疗，已在临床上取得了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了一种全新的策略。本研究采用本室建立的高通量研制筛选功能性单抗的技术方法，获得了多株能显著抑制肺癌细胞增殖的功能性单抗，为治疗肺癌提供了有潜在应用价值的抗体靶向治疗剂。
1 材料和方法
1.1 材料
小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0细胞，肺癌细胞系GLC82（肺腺癌）、NCIH520（肺鳞癌）为本室保藏。6周龄Bal b/c小鼠购自中国药品生物制品检定所。 M199、M1640、DMEM、IMEM培养基均购自Gibco BRL公司； 胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）系Hyclone 生产；biotin马抗小鼠IgG、IgM、HRP标记羊抗小鼠IgG、IgM 均购自Vector公司；αtublin兔多抗为Santa Cruz 生产；FITC标记的羊抗兔 购自Vector 公司；Cy3标记avidin 购自Jackson公司; PVDF膜由Millipore生产；DAPI购自Sigma公司；单抗亚类检测试剂盒均由SouthernBiotech公司生产；SP法免疫组化试剂盒购自福州迈新公司；Westernblot试剂购自普利莱公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SP2/0细胞采用含10%FBS的DMEM培养基培养；肺癌细胞系GLC82和NCIH520采用含10%FBS的1640培养基培养。
1.2.2 动物免疫 采用临床分离的肺癌新鲜组织标本(鳞癌、腺癌各一个) 分离单个细胞，以1×106～5×106细胞/（只·次）的剂量免疫5只Bal b/c小鼠，连续免疫12个月。
1.2.3 免疫荧光 活细胞免疫荧光：将9000/孔肿瘤细胞接种于96孔培养板，37℃、5%CO2温箱培养2天。细胞约70%汇合后，用PBS洗涤每孔中的细胞后加入一定浓度的一抗，室温孵育1 h，含1%BSA的PBS洗涤5次，每次5 min；加入60μl含0.5μg/ml biotin标记二抗或60μl含0.5μg/ml FITC标记抗体室温孵育30min，1%BSA的PBS洗涤5次，每次5min；加入 60μl 1∶1000稀释的Cy3Avidin，室温孵育30min后，PBS洗涤5次，每次5min；最后用含10μg/ml DAPI的50%甘油50μl封闭。对于固定细胞间接免疫荧光，在加入一抗前细胞经4%多聚甲醛固定10min，0.2% Triton X100通透5min，后续试验操作同活细胞免疫荧光。上述实验中，每种单克隆抗体重复做3孔。
1.2.4 细胞融合 待免疫小鼠血清滴度达到1∶60 000以上时，取1×108 免疫小鼠脾细胞与2×107处对数生长期的杂交瘤细胞系SP2/0融合。融合后接种30个于铺有甲基纤维素的直径35mm的细胞培养皿内。置湿盒中于5%CO2 、37℃温箱中培养。
1.2.5 免疫组织化学 免疫组化采用SP法。杂交瘤上清采用1∶5和1∶25两个稀释度。操作程序严格按照试剂盒说明书操作，镜下阳性细胞<10%定为阴性。
1.2.6 ELISA 采用SouthernBiotech的单抗亚类ELISA检测试剂盒测定筛选获得的单抗亚型，操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.7 肺癌细胞增殖测定 采用MTT法检测免疫小鼠血清对人肝癌内皮细胞增殖的影响。并同时采用RTCESTM(Real Time Cell Electronic Sensing System ) 细胞增殖测定仪实时监测单抗对人肝癌内皮增殖的作用[3]，详细按厂家说明进行操作。在细胞接种后8～16 h，加入1∶2稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清（阴性对照），继续监测细胞生长情况。细胞增殖进入平台期前终止实验，根据监测数据计算杂交瘤上清对细胞生长抑制的影响，上述实验重复了3次。
1.2.8 抗体的侵袭抑制试验 100μg/cm3 的BD Matrigel包被Corning Costar transwells的多孔的聚碳酸酯膜，37℃、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4×104人肺癌细胞系GLC82接种于transwells中。接种细胞后在transwells中加入1∶5稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37℃ 、5%CO2 培养24h后，镜检观察肿瘤细胞穿过多孔的聚碳酸酯膜后，刮除多孔的聚碳酸酯膜上层未穿过的肿瘤细胞。然后用1∶1的甲醇/丙酮溶液固定膜上细胞20min。侵袭的细胞用DAPI染核，在荧光显微镜下计数侵袭细胞数。每张膜观察4个不同的100倍视野，并经SPSS10.0进行统计分析，上述实验重复3次。
1.2.9 抗体的黏附抑制试验 96孔培养板经100μg/cm3的Collagen I包被，37℃、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4×104人肺癌细胞系GLC82接种于96孔培养板，接种细胞后在6孔培养板中加入1∶5稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37℃、5%CO2 培养1h后，每孔加入250μl无血清1640培养基振荡洗涤，每次5min，共计洗涤3次，以洗去未黏附的肿瘤细胞。随后，使用MTT法测定黏附细胞数，经SPSS10.0进行统计分析，上述实验重复了3次。
1.2.10 体内抑瘤试验 将BALB/C裸鼠分为抗体治疗组，正常鼠IgG为对照组，每组6只。将人肺癌细胞系GLC82按100万细胞/只小鼠的比例接种所有各组的BALB/C裸鼠皮下。接种后5天（已能扪及肿瘤时）开始腹腔注射纯化抗体进行治疗。注射剂量200μg/(次·只)，治疗第一周，每天1次，连续5天，以后每周2次。20天时处死小鼠，测瘤重，计算肿瘤生长抑制率。
2 结果
2.1 小鼠免疫血清的测定
从食管癌新鲜组织标本中分离单个细胞，免疫Balb/c小鼠5只，分别于免疫后3、5、9、11、13个月从小鼠尾静脉取血分离血清。免疫后9个月时固定细胞免疫荧光检测小鼠血清的抗体滴度为1∶20 000～1∶60 000。其中4号小鼠血清滴度最高，为1∶60 000，见图1a。此后两次采血检测免疫血清的抗体滴度不再显著升高，准备融合。
用MTT 法检测这只小鼠免疫第9个月的免疫血清对人肺癌细胞增殖的抑制作用，结果如图1b。随着血清浓度的增加，免疫血清对肺癌细胞增殖的抑制作用增加，并呈现明显的量效关系。1∶50稀释的免疫鼠血清对人肺癌细胞增殖的抑制达43%，而1∶50稀释的正常鼠血清对人肺癌细胞增殖没有明显的抑制作用，表明该免疫血清中含有能显著抑制人肺癌增殖的功能性抗体。
2.2 细胞融合及阳性克隆的筛选
待免疫小鼠血清中的抗体滴度不再升高时，取滴度最高的4号小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，融合细胞接种40个含有HAT选择培养液的甲基纤维素培养基的平皿中。培养8～12天后，从培养皿中挑取孤立的较大的细胞集落，共计挑取2652个单集落细胞克隆，接种30个96孔培养板，最终从中获得了1573个单克隆。以αtublin作为细胞膜是否被通透的对照，采用活细胞免疫荧光法检测筛选了1573个杂交瘤克隆上清与2种肺癌细胞系GLC82和NCIH520的反应。如果对照αtublin的免疫荧光阳性则说明细胞膜已经被通透，抗αtublin的抗体分子进入了细胞；如果αtublin为阴性，说明细胞没有被通透，抗体无法进入细胞内，见图2。因此，这时的阳性反应表明该抗体是与细胞膜上的蛋白结合，即此抗体的抗原是膜蛋白，此抗体也可能作为抗肺癌靶向治疗的抗体。最终我们获得了314个与2种肺癌细胞膜均呈阳性反应的克隆。采用免疫组织化学法检测了上面314个阳性克隆的杂交瘤上清与正常肺组织的反应性，结果获得了154个与正常肺组织不反应或低反应的单抗克隆。
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