【摘要】 目的 通过观察硫代磷酸化修饰的Ki67抗原反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide, ASODN)抑制Ki67抗原表达，从而抑制HEPG7402细胞体外增殖,为今后肝癌的基因治疗提供新的手段。方法 将Ki67反义寡核苷酸(ASODN)作用于HEPG7402细胞, MTT比色法测细胞增殖活性;免疫细胞化学(Immunocellulerchemistry ICC)方法检测Ki67标记指数（Labeling index LI）、RTPCR方法观察Ki67 mRNA水平的改变。结果 Ki67 ASODN作用组HEPG7402细胞增殖受到明显抑制;Ki67标记指数(LI)下降,Ki67mRNA合成减少。结论 针对Ki67的反义寡核苷酸能抑制人肝癌细胞株的体外生长。
【关键词】 Ki67 反义寡核苷酸 Ki67标记指数 肝癌
0 引言
肝癌是我国消化道常见肿瘤之一，常规手术治疗根治率低，其他治疗手段效果一般。基因治疗是目前肿瘤治疗中一种较有前景的治疗方法。反义核酸技术是利用一断人工合成的寡核苷酸与异常表达或过度表达的目的基因或目的基因mRNA互补结合，可以在复制、转录、翻译等多个水平上抑制目的基因的表达，达到治疗的目的。肿瘤的发生与细胞的过度增殖有关，本实验通过将一段针对细胞核增殖相关抗原Ki67翻译起始区的反义寡核苷酸片断，作用于人肝癌细胞HEPG7402，观察对肝癌细胞HEPG7402增殖的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
人肝癌细胞HEPG7402购自中科院上海细胞研究所； Ki67免疫组化试剂盒、SP试剂盒购自福州迈新试剂公司；Trizol RNA抽提试剂盒、AMV RTPCR扩增试剂盒为上海生工公司产品。针对Ki67的反义链(ASODN)序列：5’ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT3’; 随机链（ROND）序列：5’AGT ACT CAG TAA CGC CTA CGG TAA G 3’;上述序列3’端3个碱基硫代磷酸化修饰，HLPC纯化处理。寡脱氧核苷酸的合成及纯化由上海生工公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
人肝癌细胞HEPG7402在含10％小牛血清、100U/L青霉素/链霉素的RPMI1640培养基,37℃,5% CO2饱和湿度下培养。实验分组根据加入药物的不同分为反义核酸作用组(ASODN组)、随机寡核苷酸组(ROND组)和对照组。
1.2.2 MTT法[1]检测细胞增殖活性
将ASODN作用于HEPG7402，分别于24、48、72、96h加入0.5% MTT 20μl,孵育4h后吸弃培养基，加入DMSO 150μl，紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞的490nm吸光度值。
1.2.3 免疫细胞化学法检测标记指数（LI）
制备细胞爬片，经药物处理培养48ｈ后取出玻片,采用免疫细胞化学SP法，根据试剂说明操作。以细胞核呈棕红色为阳性;单纯细胞浆着色而细胞核无着色,或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。通过计算 Ki67标记指数（LI）反映Ki67抗原表达量的改变。
1.2.4 RTPCR观察Ki67 mRNA水平的改变
收集各组细胞，用Trizol柱式总 RNA抽提试剂盒提取总RNA，按照AMV一步法 RTPCR扩增试剂盒说明操作。Ki67 mRNA上游引物5’TTT GGG TGC GAC TTG ACG A –3’；下游引物5’TGA TAG TAA CCA GGC GTC TCG T –3’，产物181bp。内参GAPDH上游引物5’CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA –3’；下游引物5’TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC –3’，产物598bp。由上海生物工程公司合成。
1.2.5 统计学分析
采用SPSS10.0软件分析,多组均数间的比较,检验方差齐性后行方差分析。
2 结果
2.1 ASODN对HEPG7402细胞生长曲线的影响
ASODN作用组，24～72h细胞增殖受到抑制，抑制作用与对照组相比有统计学意义P＜0.05，96h以后抑制作用减弱，见图1。
2.2 ASODN作用下Ki67 LI改变
ASODN作用组，当ASODN浓度为2.5μmol/L 时，LI改变与对照组无明显区别（P＞0.05），随ASODN浓度增加，Ki67 LI明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。
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