【摘要】 目的 研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinduced kill cells,CIK)对 ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。方法 应用MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果 MTT比色法表明随着CIK细胞与乳腺癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强（P<0.01）。CIK细胞作用于乳腺癌细胞24h后，形态学观察乳腺癌细胞发生凋亡或坏死。结论 CIK细胞是一种新型高效具有较强杀伤体外乳腺癌细胞的免疫活性细胞。
【关键词】 CIK细胞 ZK751乳腺癌细胞 抗肿瘤 细胞凋亡
0 引言
从80年代Rosenberg等观察到在患非免疫系统肿瘤的动物中给予重组白细胞介素2（IL2）， 动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移以来， 细胞免疫治疗就迅速扩展开来， 人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞， 肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞， CD3单抗激活的杀伤(CD3AK)细胞， 但是由于细胞来源困难、 细胞扩增倍数低或者细胞毒力不高等原因， 上述细胞的临床应用受到极大限制。 为此， 美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心1991年首先报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinduced kill cells, CIK)细胞[1]。 目前， 国内尚未见应用CIK细胞体外诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察和机制探讨。 本课题通过光镜、 电镜观察了CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株作用的形态学变化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品及试剂 基因重组人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴细胞分离液、基因重组人IFNγ、RPMI Medium 1640培养基、IMDM培养基、胎牛血清、MTT。
1.1.2 肿瘤细胞 ZK751乳腺癌细胞株由西安医科大学肿瘤研究所提供，由本科室体外传代培养。
1.2 方法
1.2.1 效应细胞制备 取健康者的成分白细胞用淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）经Ficoll密度梯度离心法（density gradient centrifugation）提取单个核细胞（PBMC），此细胞被重悬并保存于IMDM 培养液中（含10％ FCS）。调至１×10６个/ml，第0d加入IFNγ 2 000u/ml，PHA 100μg/ml放置37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24h，第1d加CD3 McAb 5μg/ml,重组人IL2 1 000u/ml,继续培养。每3d半量换液，同时补加IL2 1 000u/ml，PHA 100μg/ml调细胞浓度至１×10６个/ml，第14d收获细胞。
1.2.2 MTT法测量细胞存活率 取对数生长期乳腺癌细胞0.4％台盼蓝染色及计数，调整浓度至1×105个/ml细胞悬液为靶细胞，取培养14d的CIK细胞调整浓度为１×10６个/ml为效应细胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另设单独效应细胞组（效应细胞＋培养液）及单独靶细胞组为阴性对照组（ 靶细胞＋培养液）、每组重复8孔，置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养24h、48h后取出，每孔加MTT 20μl(5mg/ml),继续培养4h后小心弃去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）160μl,轻轻振荡10min后用酶联免疫检测仪λ＝490nm测吸光度（A）值，杀伤率计算公式为：抑制率（%）＝[１－(实验孔A值－效应孔A值)/靶细胞孔A值]×100%
1.2.3 倒置显微镜观察 将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于24孔培养板内，置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养，随时在倒置显微镜下观察。设对照组为单纯培养的乳腺癌细胞。
1.2.4 HE染色观察 将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于已放置支持物小盖片的12孔培养板内。对照组：加等量生理盐水。连续培养24h后取出小盖片。将小盖片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，苏木素2min，水洗3min，0.5％盐酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊红30s，脱水、透明及封固。
1.2.5 透射电镜观察 将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1混合的4、 12及24h细胞离心， 弃去上清液， 剩下的细胞团用2.5%戊二醛固定、 梯度丙酮脱水; Epon812混合树脂包埋; 超薄切片机切片; 醋酸钠和柠檬酸铅染色; 透射电镜观察、照相。
1.2.6 统计学处理
应用SPSS11.0软件：进行统计学处理，MTT法检测的抑制率之间的比较采用t检验。
2 结果
2.1 MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞的抗增殖及细胞毒结果
随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒性明显增强。相同作用时间不同效靶比之间有显著性差异（P<0.01或P<0.05），同一效靶比不同作用时间之间也有显著性差异（P<0.01）。当效靶比为30∶1时，其抑制率为48.60%±9.57%，接近半数抑制浓度，有效作用时间为24h，见表1。
表1 用MTT法测定CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抑制率（略）
Note: Compared with the former at the same timeΔP<0.05; Compared with the former at the same time *P<0.01;Compared with the former at the same E/T ▲ P<0.01(n=6)
IGF1和IGF2表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的相关性
bax基因对人BcaCD885颊癌细胞凋亡的影响