作者：赵长宏,陆海波,马玉彦 ,鲁海玲,唐雅莉,李鑫 '
【摘要】 目的 应用SELDI蛋白质芯片检测胃癌患者血清蛋白质指纹图谱，筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，并探讨其诊断早期胃癌的临床意义。方法 表面加强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDITOFMS）技术及其配套蛋白质芯片检测34例胃癌患者（Ⅰ/Ⅱ期12例与Ⅲ/Ⅳ期22例）和30例健康人的血清蛋白质组图谱，运用判别分析处理数据筛选标志物并建立诊断模型。结果 2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5个蛋白质峰组合所构建的诊断模型能达到鉴别胃癌患者和健康人的最佳诊断效果，特异度94.1%（32/34）， 灵敏度93.3%（28/30）。单个4 665m/z蛋白质峰诊断模型可达到鉴别Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期胃癌效果，其特异度91.6%（11/12），灵敏度95.4%（21/22)。结论 该方法在胃癌的诊断尤其是早期诊断、术前分期及候选肿瘤标志物筛选等方面具有一定价值，值得进一步研究。
【关键词】 早期胃癌 SELDITOF 诊断；蛋白质组学
Detection and Evaluation of Serum Proteomic Patterns by SELDITOFMS in Early Gastric Cancer
Corresponding Author:LU Haibo,Email:lu_haibo200@126.comAbstract：Objective To detect the serum proteomic patterns using SELDITOFMS ProteinChip array technology in gastric cancer,screen biomarker candidates,build diagnostic models and evaluate its clinical significance in early gastric cancer.Methods SELDITOFMS ProteinChip was used to detect the serum proteomic patterns of 34 patients with gastric cancer （12 cases of Ⅰ/Ⅱstage and 22 cases of Ⅲ/Ⅳ stage） and 30 healthy people.The diagnostic models were developed and validated by discriminant analysis.Results The model composed by 5 protein peaks 2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z and 1 588m/z could do the best in the diagnosis of gastric cancer.The specificity and sensitivity of it were 94.1%（32/34）and 93.3%（28/30） respectively.The single peak 4 665m/z can distinguish stageⅠ/Ⅱstage and Ⅲ/Ⅳ gastric cancer,the specificity and sensitivity of it were 91.7%，(11/12) and 95.4%，(21/22).Conclusion This method show great potential for the early detection,staging before operation and screening novel and better biomarkers to early gastric cancer.
Key words：Early Gastric cancer; SELDITOF; Diagnosis; Proteomics
胃癌是常见恶性肿瘤之一，在世界范围内为第二多发恶性肿瘤，是消化系统最多发肿瘤[1，2]。可能是胃癌临床的异质性表现，迄今为止胃癌尚缺乏理想的肿瘤标志物，从而也给其早期诊断、术后疗效评价、预后监测及胃癌患者的康复等造成了一定的困难。
表面加强激光解吸电离飞行时间质谱（Surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry,SELDITOFMS）是近年来发展起来的一种全新的蛋白质组学研究手段，其基本原理是通过特定的化学表面结合蛋白质分子再以激光轰击，使蛋白质成为离子而飞行于电场中并被检测器所测得，进而用不同位置、强度的峰来表示各种不同的蛋白质及其相对含量，最终形成可用于分析的图谱。该方法克服了传统蛋白质组学研究方法所存在的诸多问题，实现了质谱技术用于临床检测的飞跃[3，4]。
本研究应用SELDI质谱仪及其配套蛋白质芯片检测了34例胃癌患者和30例健康人的血清蛋白质指纹图谱，以筛选可用于临床胃癌早期诊断的特异性生物标记物。
1资料和方法
1.1资料 2004年1月～8月间我院收治的初诊胃癌患者34例，中位年龄52岁（34～74岁）。常规根治手术后按UICC 1997年胃癌 PTNM分期法进行分期，其中Ⅰ期患者6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期5例， Ⅳ17例，诊断均经术后病理证实。健康人群来自我院经胃镜取材并经病理证实的无胃部疾病的30例，中位年龄49岁（25～72岁）。所有血样均于清晨空腹采集，静置离心分离血清，－80℃低温冰箱保存。
1.2主要仪器、软件及试剂 PBSⅡ表面加强激光解吸电离飞行时间质谱仪（SELDITOFMS）、能量吸收分子SPA、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software 3.2.1（美国Ciphergen公司）；HEPES缓冲盐（Sigma公司）；CHAPS缓冲盐（Sigma公司）。
1.3方法 CM10 芯片（弱阳离子+疏水膜）
1.3.1步骤 用HPLCH2O洗涤芯片，400r/min，震荡5min三次。先将10mM/L HCL倒入带盖试管中盖好后。震荡5min。在用去离子水冲洗数次，再将芯片装入HPLCH2O试管中震荡5min。将芯片架子，胶垫超声清洗干净，用去离子水冲洗数次晾干后，将芯片装入处理器上。每孔加入200μl 0.1M NaAC 结合buffer,室温振荡250r/min,5min重复一次。甩干后再上样品。
1.3.2样品处理 ①血清样品冰上溶解，4度离心10 000r/min，5min。取上清20μl加入30μl U9(含DTT)混匀，4度震荡250/min,20min,每孔用封口膜封好。②U1配法：100μl U9(含DTT)+900μl 50 mMHepes pH 7.0。③每孔加入100μl U1缓冲液混匀，盖严振荡250r/min，30min。④从上述150μl 变形样品中取出50μl,加入到200μl 0.1M NaAC 结合buffer 中混匀，取出100μl 上样，室温振荡250r/min,60min,取出样品。⑤每孔加入150μl 0.1M NaAC buffer,室温振荡250r/min,5min,倒掉后加入150μl NaACbuffer,共3次。再用1mM Hepes pH 4.0 淋洗芯片30s,重复一次。除去芯片晾干。⑥将SPA高速离心30s,在SPA管中，加入200μl乙腈，200μl 1% TFA充分振荡5min，静止5min。离心1 000r/min 1min。⑦每孔加入SPA 0.5～1.0μl/点，重复一次。两次之间各点风干。
1.3.3芯片检测 用加有Allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，在Ciphergen ProteinChip软件中设定读片程序读取芯片数据。计算机以每秒1×109Hz的速度获得原始数据并快速精确地绘制出蛋白质质谱图。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。
1.3.4蛋白质质荷比 结合SPA后的蛋白质在SELDITOFMS氦氖激光器的激光轰击下电离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比（M/Z）与电离飞行时间的平方成正比。由E=UZ=1/2mv2；t=L/v推出M/Z=Kt2=(2U/L2)t2。其中Z为离子所带电荷数，U为电压，v为飞行速度，L为加速飞行电场电压，K为常数。
1.3.5蛋白质相对含量 带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生的瞬时电流（瞬时电流It=Q/t，其中Q为t时刻检测器检测到的电荷数）转换成蛋白质的相对含量。
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