作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚
［摘要］ 目的 检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(mrd)，同时 分析 其对预后判断的指导价值。 方法 建立逆转录pcr(rt/pcr)用以检测apl患者pml/rarα。结果 rt-pcr方法敏感而可重复。 治疗 前apl患者的rt-pcr阳性率为92.8%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后mrd阳性率为56.7%(21/37)。另外，mrd阳性与缓解后apl患者的复发有关，并可以作为缓解后预测apl患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论 rt-pcr能够检测apl患者的mrd和作为预测复发的指标。
［关键词］ 急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；rt/pcr
白血病患者完全缓解（cr）后的微小残留病（mrd）已被证实与复发有关［1］。mrd的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标［2］。在 目前 血液病的 应用 实践中，mrd检测的最好例子是骨髓移植后rt-pcr法检测慢性粒细胞白血病（cml）的bcr-abl融合基因［3］。
急性早幼粒细胞性白血病（apl）以特异的染色体t（15;17）（q22;q21）易位为特征［4］。最近，许多实验室发现t（15;17）易位后，通过15染色体上的pml基因和17染色体上的rarα基因并列而导致融合基因pml/rarα形成［5］。根据pml断裂点的位置不同，可以产生2个主要的pml/rarα异构体。断裂点位于pml内含子3或4（bcr3），则pml外显子3（p3）和rarα外显子3（r3）之间形成短（s）型融合mrna产物，而断裂点位于pml内含子6（bcr1）或下游，pml内含子6（p6）和rarα外显子（r3）形成长（l）型融合体［6，7］。rt-pcr法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增pml/rarαmrna异构体［8］。另外，rt-pcr的高度敏感性使得mrd的检测成为可能，并可在apl患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。
1 资料与方法
1.1 病例选择 本 研究 中的42例患者均为1993～2000年发病，男26例，女16例，年龄12～72岁，根据fab标准［9］诊断为apl。全部病例均经全反式维甲酸（atra）治疗［30～60mg/（m2·d）］诱导缓解。巩固化疗方案为标准的hoap或da方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的atra与化疗联合治疗方案维持治疗［10］。骨髓单个核细胞用ficoll分离并保存于液氮中。
1.2 rna提取 10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离心4000r/min 20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提rnas［11］。提取时注意避免样品间的交叉污染。
1.3 筑巢式rt-pcr检测 apl的pml/rarα检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。
逆转录引物：a 5-tggatgctgcggcggaagaagcccttgcag-3
pml/rarα引物：b 5-gtcataggaagtgaggtcttc-3c5-ccgatggcttcgacgagttc-3 d5-ctcacaggcgctgaccccat-3e5-aacagcaaccacgtggccag-3f5-ttcaaggtgcgcctgcagga-3 g5-agcctgaggacttgtcctga-3h5-gctgctctgggtctcaat-3
正常rarα转录引物：i5-gcctccctacgccttcttcttct-3 j5-aaagcaaggcttgtagatgc-3 k5-gaccactctccagcacca-3l5-gctgggcactatctcttcagaact-3
rt-pcr方法与步骤按照早期报道的方法进行［12］。
1.4 pcr产物分析 取10μl第2轮pcr产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1μg/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针（h）杂交，放射自显影30min，拍片。
1.5 统计学方法 采用t检验。
2 结果
2.1 pcr产物的结果及其敏感度 pml/rarα的l、s异构型（见图1）。rt-pcr的敏感度为2.5×10-6。
图1 pml/rarα类型
2.2 rt-pcr阳性百分率 用全反式维甲酸治疗前apl患者pml/rarα的检测，34例为l型阳性，5例为s型阳性。l型、s型或2型的总阳性百分率分别为80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。apl患者cr后的mrd阳性率是56.7%（21/37）。见表1。
表1 apl患者rt—pcr检测阳性率的变化
注：*2 cases with apl not getting cr
2.3 apl患者mrd的变化 缓解不同时期的apl患者mrd的变化（见图2）。结果显示：cr后mrd百分率降低，5～7年mrd百分率比缓解后低（p<0.05）。另外，长期cr的7例中有5例生存超过7年，并且持续mrd阴性。
图2 cr时间与mrd变化关系
2.4 复发与mrd之间的关系 见表2。结果显示，在2年和3年内，mrd阴性的apl患者复发百分率低于mrd阳性apl患者的复发百分率（p<0.05）。缓解2年和3年内，mrd阴性患者第一次复发的平均时间（月）低于mrd阳性患者（p<0.05）。
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