作者;章扬培，鲍国强，任会明，季守平
o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶(o6-methylguanine dna-transferase，mgmt)，是细胞修复dna损伤的一种酶，这种酶又被称为o6-烷基鸟嘌呤dna烷基转移酶(agat)。顾名思义，此酶可以修复由各种烷化剂(alkylating agents)造成的细胞dna烷基化损伤，特别是dna分子中鸟嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化损伤。根据mgmt基因及其表达水平的不同，将细胞特别是肿瘤细胞分成mer＋和mer－两种类型：mer＋对烷化剂耐药，mer－对烷化剂敏感，即细胞中的mgmt水平决定了细胞对烷化剂的耐药程度；接着 科学 家集中精力 研究 如何克服mer＋细胞耐药性的 问题 ，发现o6-bg可以有效克服mer＋细胞对烷化剂耐药性。这些研究为开展甲基转移酶mgmt与肿瘤预见性、个体化 治疗 奠定了基础。
1 mgmt与肿瘤预见性、个体化治疗
化疗是治疗肿瘤的有效手段之一。 影响 化疗效果的主要问题是克服肿瘤对药物的耐药性。因此在化疗之前，预先判断患者对药物是否耐药是实施肿瘤预见性、个体化化疗的前提。烷化剂类化疗药物占国产的化疗药物的1/4，这类药物的作用机制明确，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物主要攻击细胞的dna，造成dna烷基化损伤，进而形成dna交联，导致细胞死亡。在12种dna烷化损伤中，以o6-甲基鸟嘌呤dna的损伤威胁最大，是引起细胞致死的重要原因。 文献 报道细胞内的o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶可使dna烷基化特别是甲基化的损伤得到修复，是细胞对烷化剂药物产生耐药性的根本原因［1～3］。如果能够建立检测肿瘤细胞中mgmt的 方法 ，就可以依据mgmt酶活性或酶蛋白水平的高低，合理使用烷化剂类药物：即对mgmt蛋白水平低的肿瘤直接使用烷化剂化疗，而对mgmt蛋白水平高的耐药的肿瘤，设法降低其mgmt蛋白水平，破坏其耐药的分子基础，然后使用烷化剂治疗。 中国 人肿瘤细胞中mgmt是如何分布的、肿瘤患者mgmt的分布有什么 规律 、能否通过动物实验验证mgmt蛋白水平高低与对药物耐药或敏感的相关性、能否研制出mgmt诊断试剂盒、能否研制出更有效的烷化剂类治疗药物嘧啶亚硝脲(acnu，尼莫斯汀)、能否研制出克服肿瘤细胞对烷化剂特别是对亚硝脲耐药的药物，如这些问题得到解决，就可以形成以 分析 肿瘤病人mgmt为依据、以调节mgmt为手段，对mgmt蛋白水平不同的病人，实施不同的使用烷化剂治疗的方案，实现预见性、个体化化疗。
自1987年始，历经14年，我们先后进行了20株中国人肿瘤细胞系mgmt酶活性与对烷化剂亚硝脲耐药性的分析、裸鼠治疗实验、mgmt基因结构与转录、mgmt基因转导对耐药性的影响、初步的临床治疗实验等，率先提出了分析甲基转移酶蛋白水平，进行肿瘤预见性、个体化化疗的方案，并研制出国家一类新药甲基转移酶检测试剂盒，研制出相应的治疗药物嘧啶亚硝脲(尼莫斯汀)和克服耐药性的药物链脲菌素(链佐星)，实现了与此方案相关的药物全部配套并国产化，为推行以分析肿瘤病人mgmt为依据，以调节mgmt为手段，对mgmt蛋白水平不同的病人，实施不同的使用烷化剂治疗的方案，奠定了基础。
我们收集和培养了20株中国人肿瘤细胞，包括肝癌4株、肺癌4株、鼻咽癌2株、脑瘤2株、胃癌2株、恶性黑色素瘤、直肠癌、舌癌、乳腺癌、食管癌和宫颈癌各1株，以国际公认的hela s3(mer+型)和hela mr(mer-型)细胞为对照，测定了它们的mgmt酶活性，及烷化剂acnu和bcnu处理后的细胞存活率。实验证明20株中国人肿瘤细胞对烷化剂亚硝脲的敏感性呈3种类型：第一类敏感型，如shg-44脑恶性胶质瘤细胞；第二类抗性型，如bgc-823胃癌、bel-7402肝癌和smmc-7721肝癌细胞；第三类中间型。在20株中国人肿瘤细胞中，mgmt活性低的2株，占10%。这一结果与美国scudiero报道的mgmt活性低的细胞为20%(19/93)［4］，日本ikenaga报道的为15%(6/40)［5］基本相当。进一步的mgmt酶活性分析揭示，在实验的20株细胞中，对亚硝脲敏感型的shg-44和hela mr细胞的mgmt酶活性最低；对亚硝脲呈抗性的bgc-823、bel-7402、smmc-7721和hela s3细胞的酶活性都很高。如果用细胞存活率为10%时所对应的药物浓度(d10值)作为衡量细胞对药物敏感性的指标，则细胞d10值与mgmt酶活性之间有很好的线性关系，mgmt酶活性高的细胞对亚硝脲有抗性，mgmt酶活低的细胞对亚硝脲药物敏感(见图1)。说明mgmt酶活性高低是决定肿瘤细胞对烷化剂耐药性的分子基础。
为了进一步观察肿瘤细胞mgmt酶活性与使用烷化剂药物治疗效果的关系，watatani把mgmt酶活高和酶活低的两种不同肿瘤细胞植入裸鼠体内，然后使用单功能烷化剂mnng治疗，结果mgmt低的肿瘤明显治愈，而mgmt高的肿瘤表现出耐药性［6］。我们将1×107mgmt低的hela mr细胞以及中国人shg-44脑胶质瘤细胞，相同数量的mgmt高的hela s3和smmc-7721中国人肝癌细胞接种到裸鼠体内，待成瘤后按每克鼠体重腹腔注射25μg烷化剂acnu的剂量进行治疗，每周1次，连续4周；或将acnu的剂量提高到50μg/次，治疗2次。hela mr和shg-44肿瘤移植物消失，继续观察1个月未见复发，治疗效果十分理想。而烷化剂acnu对mgmt高的hela s3和smmc-7721肿瘤移植物则无治疗效果，肿瘤移植物越长越大(见图2)。光学显微镜和 电子 显微镜观察证明，从裸鼠体内剥离出的治愈的mgmt低的肿瘤残存物中，仅能见到明显坏死的细胞和少量纤维细胞或脂肪细胞。实验充分说明烷化剂acnu对mgmt低的肿瘤细胞有很强的杀伤
图1 中国人肿瘤细胞mgmt活性与对acnu敏感性关系
1.hela mr/hela s3(acnu 0，对照);2.hela mr/hela s3(acnu 25μg/g×4);9.hela mr/hela mr(acnu 50μg/g×2);
图2 acnu对人肿瘤移植物的治疗效果
作用，进一步证明肿瘤细胞对烷化剂的耐药性与mgmt酶活性相关。提示如果能检测并确定肿瘤细胞中mgmt酶活的高低，就有可能预见烷化剂药物的治疗效果。
另一类常用烷化剂顺铂的治疗效果也与肿瘤细胞内的mgmt酶活性相关。文献报道顺铂可降低mgmt酶活与酶蛋白水平，克服肿瘤细胞对烷化剂氮烯咪胺(dtic)、替莫唑胺(tmz)的耐药性［7］。mgmt酶可修复顺铂造成的肿瘤细胞染色体sce，对抗顺铂药物作用；mgmt酶活高的肿瘤细胞对顺铂耐药，mgmt酶活低的细胞对顺铂敏感［8］。更有实验证明使用顺铂和环磷酰胺对卵巢癌的治疗效果与肿瘤细胞中的mgmt酶活性相关［9］。环磷酰胺、顺铂和亚硝脲的实验结果充分说明细胞的mgmt酶活性，决定了烷化剂药物对肿瘤的治疗效果。
不同的肿瘤细胞mgmt酶活性不同，有的高，有的低。肿瘤病人的肿瘤组织中mgmt酶活性是否也存在个体差异呢？我们分析了74例不同类型的肿瘤组织中mgmt酶活性，包括乳腺癌9例，胃癌、小细胞肺癌、肾癌、食管癌和结肠癌各5例，非小细胞肺癌24例，脑瘤14例及恶性黑色素瘤2例。发现在这些肿瘤组织中mgmt酶活性由高到低的顺序为乳腺癌>胃癌>小细胞肺癌>非小细胞肺癌>肾癌>脑瘤>食管癌>结肠癌>恶性黑色素瘤，这种组织分布规律性与临床使用烷化剂治疗肿瘤的经验基本吻合，即烷化剂药物多用于治疗酶活性低的肿瘤。同时我们还观察到即使在同种肿瘤组织中mgmt酶活性也有个体差异。在74例标本中有6例mgmt酶活性极低，包括食管癌3例，肺腺癌、脑胶质母细胞瘤和结肠癌各1例，约占8.1%。这一结果与日本isowa观察到21例肝癌中，mgmt低的占9.5%［10］；意大利frosina观察到27例脑瘤中mgmt活性低的占7.4%的结果相当吻合［11］。不同个体mgmt活性不同，必然对烷化剂的治疗效果不同。如果对这些mgmt低的患者使用烷化剂药物治疗，就有可能获得满意的疗效。而对那些mgmt高的肿瘤患者，如能设法降低其mgmt水平，就有可能克服其对烷化剂的耐药性，获得较好的治疗效果。对mgmt酶活不同的肿瘤患者，实施不同的化疗方案，即个体化治疗方案，不仅可以减轻病人的痛苦，而且可以提高化疗的水平。
据此，我们进一步构建了含人mgmt cdna和选择标记neo基因的真核表达载体psv2mgmt-neo，并利用电穿孔基因转移技术将其导入mgmt基因表达水平低的hela mr肿瘤细胞中，希望观察导入mgmt cdna是否可以改变mer-型肿瘤细胞对烷化剂的耐药性，经筛选获得了mgmt cdna转染细胞，实验证明5个转染细胞克隆中有4个mgmt酶活性和mgmt mrna表达水平均比转染前显著提高，随之带来的结果是转染细胞产生对双功能烷化剂acnu和单功能烷化剂mnng的耐药性。实验结果充分证明人mgmt基因表达与肿瘤细胞对烷化剂的耐药性有直接的关系，mgmt mrna和mgmt蛋白表达水平的提高是肿瘤细胞对烷化剂药物产生耐药性的直接原因。
2 联合用药克服肿瘤细胞对烷化剂的耐药性
以上实验充分证明mgmt mrna、mgmt酶蛋白和酶活性的高低决定了肿瘤细胞对烷化剂的耐药性。mgmt高耐药，mgmt低敏感。这就提示如果能降低或消耗肿瘤细胞的mgmt酶活性和蛋白水平，就有可能克服肿瘤细胞对烷化剂的耐药性。我们选用3株mer+型肿瘤细胞为实验材料(包括hela s3，smmc-7721和cc801)，这3株细胞的mgmt活性均较高，因此对acnu和bcnu烷化剂类药物表现出不同程度的耐药性。我们观察了使用链脲菌素(streptozotocin，stz)对mer+型细胞耐药性的改变，3株mer+型肿瘤细胞于37℃用链脲菌素处理1h后，细胞的mgmt活性明显降低。当stz的浓度为1.5mmol/l时，可使hela s3的mgmt活性从1.10pmol/mg降到0.59pmol/mg；当stz的浓度为1.0mmol/l时，可使smmc-7721的mgmt活性由0.77降到0.39；当stz浓度为0.5mmol/l时，可使cc801的mgmt活性从0.39降到0.14。这3株细胞mgmt酶活性下降后，细胞对acnu的耐药性也随之降低，d10值的改变：hela s3从114μg/ml降到68μg/ml，smmc-7721从77μg/ml降到47μg/ml，cc801从39μg/ml降到23μg/ml；如果stz的浓度提高到3.0mmol/l、2.0mmol/l、1.0mmol/l时，分别可使hela s3、smmc-7721和cc801的mgmt酶活降到0.01pmol/mg，与标准的mer-型的hela mr细胞相当。这3株mer+型肿瘤细胞对acnu的d10值也均降到与hela mr细胞相当的d10=10μg/ml水平，3株mer+型细胞对acnu的耐药性随之消失。同样，stz浓度为3.0mmol/l、2.0mmol/l和1.0mmol/l时，可使hela s3、smmc-7721、cc801对bcnu的d10值均下降到与hela mr相当的水平，细胞对bcnu耐药性也随之消失。动物实验也证明首先用100μg/g stz处理，然后再使用25μg/g acnu治疗，可将单独使用acnu治疗无效的hela s3肿瘤细胞移植物有效地治疗。实验结果充分证明使用合适浓度的链脲菌素可以有效地克服mer+型肿瘤细胞对烷化剂类药物的耐药性。为临床开展stz和acnu联合化疗提供了 参考 和依据。通过体外和体内实验，我们还证明o6-苄基鸟嘌呤(o6-benzylguanine，o6-bg)能够更快速、更有效地抑制mer+型hela s3宫颈癌细胞，smmc-7721中国人肝癌细胞，cc801中国人宫颈癌细胞的mgmt酶活性，从而有效地改变mer+型肿瘤细胞对烷化剂药物的耐药性。
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