作者:李 萃，段朝军，肖志强，易红，汤参娥，陈主初
［摘要］ 目的 建立分辨率高和重复性好的人肺鳞癌组织及其肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱，并识别鉴定出其差异表达的蛋白质。 方法 利用固相ph梯度双向凝胶电泳分离人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织的总蛋白质，凝胶经银染显色后，运用imagemaster 2d图像 分析 软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质， 应用 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（malditofms）及数据库搜索鉴定部分差异蛋白质点。结果 （1）得到了分辨率较高、重复性较好的人肺鳞癌组织和肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱，将同一癌组织和肺炎性假瘤组织分别进行了3次双向凝胶电泳，3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1569±78和1487±64，平均匹配的点数分别为1454±37和1370±43，匹配率达92.7%和92.1%；同一癌组织的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在ief方向的偏差是(0.733±0.101)mm，在sdspage方向上的偏差为(0.925±0.207)mm。（2）比较分析肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱，平均匹配的点数为1142±51，对23个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析，鉴定出一些与细胞周期调控、信号传导等有关的蛋白质。结论 建立了分辨率较高且重复性较好的人肺鳞癌组织与肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱，并识别鉴定出了一些差异表达的蛋白质，这不仅有助于进一步完善人肺癌蛋白质组数据库，而且能为人肺鳞癌发病机制 研究 及其诊断、鉴别诊断、 治疗 以及新药开发等提供线索。
［关键词］ 人肺鳞癌；肺炎性假瘤；固相ph梯度双向凝胶电泳；malditofms； 蛋白质组
establishing and analyzing differential proteomic expression profiles from human lung squamous carcinoma and inflammatory pseudotumor tissues
［abstract］ objective to establish differential proteomic expression analysis of high resolution and reproducibility twodimensional electrophoresis profiles from human lung squamous carcinoma tissues and inflammatory pseudotumor tissues.methods the proteome of human lung squamous carcinoma tissues and inflammatory pseudotumor tissues were separated and identified by using a series of methods，including immobilized ph gradient twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis，silver staining，imagemaster 2de analysis software，peptide mass fingerprint based on matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (malditofms) and database searching.results (1) the good 2de pattern of human lung squamous carcinoma tissues and inflammatory pseudotumor tissue including resolution and reproducibility were obtained.after staining，the 2de image analysis by imagemaster 2de software had detected average of 1569±78 and 1487±64 spots，1454±37 and 1370±43 spots were matched individually.the average matching rate were 92.7% and 92.1%.there had a good reproducibility of spot position in the human lung squamous carcinoma tissues maps，with average deviation in ief direction of (0.733±0.101)mm，while in sdspage direction it was (0.925±0.207)mm.(2) the map of the tumor tissues was compared with inflammatory pseudotumor tissues，1142±51 spots were matched.twentythree proteins were analyzed，some of which have the relationship of oncogenes，and others were the regulation proteins，which adjust the cell cycle and signal transduction.conclusion these data suggest that we constructed high resolution and reproducibility twodimensional electrophoresis profiles from human lung squamous carcinoma tissues and inflammatory pseudotumor tissues and analyze the differential protein spots，which will be taken advantage to establishing the differential proteomic expression profiles.it is suggested that the differential expression analysis of proteome may be useful to further study of human lung squamous carcinoma.
［key words］ human lung squamous carcinoma; inflammatory pseudotumor; immobilized ph gradient twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis; malditofms; proteome
肺癌是 目前 全球发病率最高的恶性肿瘤之一。按其组织学分类一般可分为以下4种：鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌。其中以鳞癌最为常见，约占全部肺癌例数的30%～50%。在我国尤其是在大、中城市，肺鳞癌的发病率近数十年来成倍增长，临床统计已占肺癌总数的50%～70%［1］。目前在肺癌发病的分子机制方面，已从基因和转录水平进行了许多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白质来实现，若能直接从蛋白质整体水平入手来研究肺癌，将能更加全面、真实地揭示肺癌的癌变过程。随着对蛋白质组分析技术的出现及在肺癌研究中的应用，已识别鉴定出一些肿瘤标志物并用于临床诊断，但是肺鳞癌蛋白质组研究突显不足，因此有必要对在我国发病率高的肺鳞癌开展蛋白质组研究。
本实验室先前的研究已应用固相ph梯度双向凝胶电泳技术分离了人肺鳞癌组织及相应的癌旁正常支气管上皮组织的总蛋白质，并对其差异蛋白质点进行了鉴定，得到了一些有意义的结果。由于炎性假瘤在临床上与肺癌极易混淆，因而本研究拟建立人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳图谱，再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（malditofms）及数据库搜索对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，以期为人肺鳞癌与炎性假瘤的早期鉴别诊断、治疗以及新药开发等提供线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本 7例人肺鳞癌组织及7例炎性假瘤取自中南大学湘雅一 医院 、湘雅二医院的手术切除标本，并经病理诊断确诊。
1.1.2 试剂 二喹啉甲酸（bca）蛋白定量试剂盒为pierce公司产品；硫脲、二硫苏糖醇（dtt）、碘乙酰胺、双向凝胶电泳标准蛋白质、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲—酮—胰蛋白酶（tpcktrypsin）、铁氰化钾［k3fe（cn）6］、三氟乙酸（tfa）、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（cca）、氯化钙（cacl2）均为sigma公司产品；固相ph梯度干胶条（ipg strip ph 3～10l，24cm）、ipg缓冲液（ph 3～10l）、两性电解质（pharmalyte，ph 3～10）、覆盖液、低分子量标准蛋白质、蛋白银染试剂盒、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为amershan pharmacia公司产品；甘氨酸、tris、chaps、sds、dna酶、rna酶均为promega公司产品；硫代硫酸钠（na2s2o3）、碳酸氢铵（nh4hco3）为国产分析纯；乙腈为国产色谱纯。
1.1.3 仪器 ipgphor等电聚焦仪、ettan dalt twelve system、imagemaste 2d elite 4.01凝胶图像分析软件、imagescanner扫描仪、labscan扫描控制和分析前处理软件（pharmacia公司产品）；savant冷冻浓缩机（美国）；applied biosystem voyagerdetm str biospectrometrytm workstation system 4307 malditofms质谱仪（abi公司）；elx800自动酶标仪（biotek instrumets，inc）。
1.2 方法
1.2.1 组织标本的处理 取术后新鲜的肺癌组织及肺炎性假瘤组织，无菌状态下将组织分别用生理盐水反复清洗，以去除血液，并尽可能剪去多余的其他组织。处理后的样品立即用于蛋白质的抽提或置于-80℃保存。
1.2.2 组织总蛋白质的制备 30～80mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，置于400ml裂解液（7mol/l urea，2mol/l thiourea，2% np-40，1% triton x-100，100mmol/l dtt，5mmol/l pmsf，4% chaps，0.5mmol/l edta，40mmol/l tris，2% pharmalyte，1mg/ml dnaseⅰ，0.25mg/ml rnase a）中，充分旋涡混匀，置于37℃孵育箱孵育1h，取出后再充分旋涡，4℃，15000r/min离心30min［2］，吸取上清液即为组织的总蛋白质，用bca蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度。
1.2.3 固相ph梯度双向凝胶电泳 （1）第一向固相ph梯度等电聚焦:ipgdalt主要按以往的方法进行［2］。将已定量总体积为450ml的组织总蛋白质抽提物与水化液加入24cm ipg持胶槽，放置好ipg干胶条，ph 3～10l（240mm×3mm×0.5mm）后，于ipg phor等电聚焦仪上水化和聚焦在20℃自动进行，总电压时间积为69920vh，其中于30v低电压水化14h，然后经过500v 1h、1000v 1h，最后稳定在8000v下进行等电聚焦。（2）平衡:等电聚焦结束后，迅速取出一向的ipg胶条先后置于10ml平衡液a（50mmol/l trishcl ph 6.8，6mol/l urea，30%甘油，1% sds，0.2% dtt）和10ml平衡液b（50mmol/l trishcl ph 6.8，6mol/l urea，30%甘油，1%sds，3%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝）中分别平衡15min。（3）第二向垂直板sdspage电泳:将平衡后的胶条移至1mm厚的12.5%均匀分离胶的上端，用0.5%琼脂糖封胶，15℃循环水冷却，先设置恒功率2.5w/块胶进行电泳30min，再改用恒功率17w/块胶进行电泳，当溴酚蓝离胶最底端约5mm处停止电泳。
1.2.4 银染 均按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行。
1.2.5 凝胶图像分析 凝胶通过imagescanner扫描仪以及labscan扫描软件进行扫描获取图像，利用imagemaster 2d elite 4.01分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1d校正、建立平均凝胶等分析。斑点位置的重复性按gorbett［3］的方法进行 计算 。所有数据的统计分析在spss for windows 10.0软件和excel上进行。
1.2.6 制备质谱样品 切取差异蛋白质点，对银染蛋白质用100mmol/l na2s2o3和30mmol/l k3fe(cn)6（1∶1）进行脱色，然后用100mmol/l nh4hco3，10mmol/l dtt于57℃还原1h，再在暗处用100mmol/l nh4hco3，55mmol/l碘乙酰胺烷基化30min，冻干后加入tpcktrypsin（0.1g/l）37℃酶解24h，12000r/min离心5min，取上清用millipore公司ziptiptmc18微柱进行脱盐后与cca基质液混合，轻微旋涡后均匀点样2ml于不锈钢点样板上，空气中 自然 风干待分析［2］。
1.2.7 质谱分析 将制备好的点样板置于applied biosystems voyager system 4307 malditofms仪上进行分析，采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压为20000v，反射电压比为1∶12，n2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取100 nsec，真空度4×10-7torr，质谱信号单次扫描累加50次，质谱使用胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，获得了肽质量指纹图。
1.2.8 数据库查询 通过因特网在expasy的 中国 镜像站点cbi的peptident软件中进行搜寻。搜寻参数如下：肽质量指纹图中的肽片段质量选择在800～4000da范围，表观等电点的误差范围为±0.5ph，表观分子量的误差范围为±20%，半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸（carbamidomethylcys），每个肽允许有1个不完全裂解位点，最少匹配肽片段数为4，物种来源选择人类，离子选择［m+h］+和average，另根据需要调整参数。
2 结果
2.1 人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳图谱 对来自同一标本的总蛋白质进行3次重复性的检测，发现3次双向电泳图谱非常相似，采用imagescanner扫描仪扫描获取图像，然后通过imagemaster 2d elite 4.01分析软件对其进行点分析，获得肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1569±78和1487±64。经过背景消减后，将其中的一块胶定为 参考 胶，进行3块胶间的蛋白质点的匹配，肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织平均匹配的点数分别为1454±37和1370±43，匹配率分别达92.7%和92.1%。再任意选取同一癌组织的3块胶中相互匹配且分辨清晰的50个蛋白质点，选择位置偏中间的一个点为原点，以参考胶为参考位置，测量出其他两块胶对应点在第一向等电聚焦及第二向sdspage方向上位置的偏差，发现3块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在ief方向的偏差是(0.733±0.101)mm，在sdspage方向上的偏差为(0.925±0.207)mm，因此获得了重复性较好的人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤组织的双向凝胶电泳图谱（见图1）。将两者匹配分析，平均匹配点数为1142±51。
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