【关键词】 妊娠肝内胆汁淤积症；脐静脉；血管内皮细胞；血管内皮生长因子；丹参
Study of the effects of vascular endothelial growth factor and the therapeutic mechanisms of Salvia Miltiorrhiza Bge in intrahepatic cholestasis of pregnancy
【Abstract】 Objective To sudy the effects of vascular endothelial growth factor and the therapeutic mechanisms of Salvia Miltiorrhiza Bge in intrahepatic cholestasis of pregnancy(ICP). Methods Twelve patients with ICP and twelve normal pregnancy women take part in this study,their serum is collected before therapy when in hospital. Endothelial cells are isolated from human umbilical veins choosed among the 10 normal pregnancy according to Jaffe’s method, serum of different concentration of ICP groups and normal pregnancy groups is cocultured with HUVECs for different time point respectively. MTT method is applied to measuring the vitality of HUVECs.The expression value of vascular endothelial growth factor(VEGF) is detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Results Compared with normal pregnancy , the value of MTT in ICP serum groups,the A value is significantly lower,P<0.05. The value of soluble VEGF in ICP serum group is lower than that in the nomal pregnancy serum group.With the serum concetration increases, the value of sVEGF decreases in the ICP groups . Compared with ICP group, the value of MTT and sVEGF in the Salvia Miltiorrhiza Bge therapeutic group increases with the concentration increase,8mg/ml of Salvia Miltiorrhiza Bge is the optical concentration. Conclusion Serum of ICP patients impairs HUVECs in vitro and decreases the expression of VEGF. The mechanism of serum of ICP patients impairs HUVECs maybe by decreasing the expression of VEGF. Salvia Miltiorrhiza Bge could protect HUVECs against the injury of ICP serum and promotes the expression of VEGF. Salvia Miltiorrhiza Bge improves HUVECs by increasing the value of VEGF.
【Key words】 intrahepatic cholestasis of pregnancy; umbilical vein; vascular endothelial cell(VEC);vascular endothelial growth factor; Salvia Miltiorrhiza Bge
妊娠肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是一种妊娠特异性的疾病［1］，以孕妇出现全身或局部皮肤瘙痒、黄疸及胆酸增高为特征。ICP可引起严重的围生儿并发症，围生儿发病率和死亡率明显增加。关于ICP胎儿宫内缺氧的机制尚不清楚。胎盘-胎儿血供受到一系列生长因子的调节，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是一种直接而特异作用于血管内皮细胞的高效促有丝分裂因子，在刺激新血管发生与生长及维持血管壁的完整性和通透性方面均有重要意义。VEGF对于受精、着床、胎盘血管形成及胎儿生长发育起着重要的作用。表达异常则可能导致胎儿宫内氧供不良，对围生儿产生不良影响。具有行气活血作用的中药—丹参，临床上被用于治疗ICP以改善围生儿预后。本文以ICP患者血清与正常脐静脉内皮细胞共培养并用不同含量的丹参注射液进行干预，探讨VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用，以及丹参活血化瘀改善胎儿血供的可能机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象 收集2003年8～12月在东南大学附属中大医院和南京市妇幼保健院妇产科住院的正常妊娠和ICP患者各12例，无菌抽取孕妇肘前静脉血。选取择期剖宫产的足月妊娠脐带10例。纳入标准：正常妊娠组：整个孕期无合并症或并发症；ICP组：ICP诊断标准遵照《中华妇产科学》［2］，并排除合并妊高征，糖尿病、肾病、原发性高血压、贫血及其他内科合并症。孕龄诊断正确，否认有吸烟、激素治疗史。剖宫产指征：均未临产，系因骨盆、胎位、珍贵儿及社会因素等而行择期剖宫产者。
1.2 方法 参照Jaffe法行脐静脉内皮细胞原代培养，经倒置相差显微镜、Giemsa 染色和人第Ⅷ因子抗原鉴定为血管内皮细胞。以正常妊娠孕妇血清作为对照,当细胞融合60%-80%时，加入不同浓度的ICP患者血清刺激24h， MTT法检测脐静脉内皮细胞的活力；不同含量的ICP患者血清分别刺激12h、24h、36h，按照ELISA试剂盒操作步骤检测培养上清液中分泌型可溶性VEGF的变化。不同含量的丹参注射液进行干预，分别检测细胞活力和VEGF蛋白的变化。
1.3 试剂和仪器 RPMI Medium 1640培养基：GIBCO BRL公司产品；胎牛血清(100ml/瓶)：杭州四季青生产；Ⅳ型胶原酶：H＆Y biochemical corporation 公司产品；MTT粉剂，购自SIGMA公司；ELISA试剂盒购自晶美生物工程北京有限公司。GBB16型CO2培养箱，OLYMPUS CK2型倒置显微镜，SPECTRA MAX250型酶联免疫检测仪，96孔培养板。
1.4 统计学分析 数据均以x±s表示，组间多个样本均数间比较采用方差分析，两两之间用q检验，两样本均数比较用成组t检验。（采用SPSS 11.5统计软件）
2 结果
2.1 ICP患者血清对脐静脉内皮细胞活力的影响 ICP患者血清刺激内皮细胞24h后，细胞吸光度（A）值随着浓度的增加逐渐降低；并低于相应浓度的正常血清组（P<0.05）。具体数据如表1所示。
表1 不同浓度的正常孕妇和ICP患者血清干预后HUVECs的A值（略）
2.2 ICP患者血清对脐静脉内皮细胞分泌VEGF蛋白的影响 不同浓度的 ICP患者血清刺激不同的时间，HUVECs分泌VEGF蛋白量具体数据见表2。ICP患者血清各浓度组均低于相应浓度正常组，有统计学差异。随着血清含量的增加，VEGF蛋白量降低，有统计学差异。此外随着ICP患者血清与HUVECs作用时间的延长，VEGF蛋白的分泌量逐渐降低。
表2 不同浓度的ICP患者血清干预后HUVECs分泌VEGF蛋白量（略）
注：10%ICP患者血清组，24h、36h和12h相比 △P<0.05；20%ICP患者血清组，24h、36h和12h相比△△P<0.05
2.3 丹参注射液对脐静脉内皮细胞活力的影响 在20%ICP患者血清干预的同时，分别加入不同含量丹参注射液共同培养24h后，相应组别的细胞吸光度（A）值见表3。与ICP患者血清组相比，随着丹参含量的增加，其A值逐渐增加。
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