针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用(1)

                        作者：秦炜炜，刘家云，张瑞，王涛，王凯，孟艳玲，杨安钢

【关键词】  乙型肝炎病毒；,RNA干扰；,腺病毒；,基因治疗

　　Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression

　　【Abstract】  AIM: To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx）  and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E. coli BJ5183 with adenovirus backbone plasmid. The  homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified, followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene. The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total RNA and protein were collected.  RESULTS: The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed, which were confirmed by restriction enzyme digestion. RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed that the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line. CONCLUSION: Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro.

　　【Keywords】 hepatitis B virus; RNA interference; adenovirus; gene therapy

　　【摘要】 目的：构建针对乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体，并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用. 方法：重组腺病毒穿梭载体pShuttleHBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体，后者转染HEK293细胞，包装并扩增出病毒颗粒. 用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2，收集细胞总RNA和总蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化. 结果：经限制性内切酶酶切鉴定，证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功. RTPCR和Western Blot方法证实，在HepG2细胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低. 结论：腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.

　　【关键词】 乙型肝炎病毒；RNA干扰；腺病毒；基因治疗

　　0　引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因组中，HBx基因编码的HBX蛋白是HBV编码蛋白中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质［1-2］，可以激活宿主细胞中受损DNA的修复［3-4］，并且同多种肿瘤相关分子有相互作用. 因此认为，HBX与肝细胞肝癌的发生和发展密切相关. RNA干扰(RNA interference, RNAi)是双链RNA (doublestrand RNA, dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，并参与基因表达的调控［5-6］. 我们构建针对HBx基因重组腺病毒干涉载体，在人肝癌细胞株HepG2中检测其对HBx基因表达的抑制效果，为乙型肝炎病毒感染以及感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　含有针对HBx基因的两个干涉靶序列的干涉表达质粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉序列分别针对HBx基因的301~319位和198~216位），表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc，对照载体AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大肠埃希菌DH5α，HEK293细胞以及人肝癌细胞HepG2（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）. pAdeasy1腺病毒重组系统（Stratgene公司）；限制性内切酶Xba I，Hind III和T4 DNA连接酶（ TaKaRa公司）；限制性内切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HDMEM培养基和RPMI 1640培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂（Invitrogen公司）； myc标签, EGFP多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；ECL化学发光试剂盒为（Pierce公司）. 用于扩增HBx基因的上游引物：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于扩增内参照βactin基因的上游引物: 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′, 下游引物: 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于扩增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′， 下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′,上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的构建

　　经Xba I和Hind III双酶切反应，从pSUPERHBx2，pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5（大小300 bp左右），将两目的片断回收后亚克隆入同样经Xba I和Hind III双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用Xba I和Hind III双酶切，10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 获得含小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.

　　1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的构建

　　将pShuttleHBx2，pShuttleHBx5质粒用Pme I酶切线性化，与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌. 卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取较小的克隆扩增培养，提取质粒. 用Pme I酶切鉴定质粒，将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，扩增阳性克隆并大量提取质粒，得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒. （阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒，用Pme I酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到）.

　　1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定

　　①包装细胞培养：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培养基，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70%~80%时转染.  ②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切线性化后回收，按照LipofectAmineTM2000说明书转染6孔培养板中的HEK293细胞，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，10~12 d后收集细胞，液氮与37 ℃两个温度下反复冻融4次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增. 重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-70℃. ③病毒滴度的测定：用 TCID法检测病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液.

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