氟伐他汀对哮喘大鼠气道重建的影响及其机制(1)

【关键词】  氟伐他汀;,支气管哮喘;,气道重建;,癌基因蛋白质p21(ras)

　　Effect of fluvastatin on airway remodeling in asthmatic rats and its mechanism

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of hydroxymethylglutarylCoA (HMGCoA) reductase inhibitor, fluvastatin, on airway remodeling  in asthmatic rats. METHODS: The male SpragueDawly rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats in each group: the normal control group (A), the model group (B), the dexamethasone treated group (C), the fluvastatin treated group (D), and the dexamethasone and fluvastatin treated group (E). The asthmatic rat model was established by intraperitoneal injection and repeated inhalation of 10 g/L ovalbumin. The changes of collagen type Ⅲ , proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and P21ras contents in the airway wall were detected by immunohistochemistry, and the internal perimeter of bronchi (Pi) and the area of bronchial smooth muscle (WAm) were measured by the computerized image analysis system. RESULTS: ①Fluvastatin inhibitated the proliferation in airway remodeling: The WAm/Pi ［(4.44±0.95) μm2/μm］, the contents of collagen type Ⅲ (32±6) and PCNA (38±10) in group D were lower than those in group B ［(7.01±1.54) μm2/μm, 55±8, 68±12］, the difference being significant (all P<0.05); ②Fluvastatin was less effective in inhibition on the course of airway remodeling than dexamethasone and dexamethasone and fluvastatin combination : The WAm/Pi, the contents of collagen type Ⅲ and PCNA in group D were higher than those in group C ［(3.14±1.06) μm2/μm, 21±6, 26±6］ and group E ［(3.03±0.87)  μm2/μm, 20±7, 25±7］ respectively, the difference being significant (all P<0.05). ③The contents of P21ras in group D (24±11) were lower, as compared with group B (57±10, P<0.05). A close correlation was demonstrated between P21ras and PCNA (rs=0.685, P<0.05). The same positive correlation was found between P21ras and collagen type Ⅲ (rs=0.530, P<0.05). CONCLUSION: Fluvastatin could delay the course of airway remodeling in asthmatic rats, which is related partly to the inhibition on P21ras. But the inhibition of fluvastatin on the course of airway remodeling is less effective than the inhibition of dexamethasone.

　　【Keywords】 fluvastatin; asthma; airway remodeling; oncogene protein p21(ras)

　　【摘要】 目的：观察羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂氟伐他汀对大鼠哮喘模型气道重建的影响. 方法：将50只SD雄性大鼠随机分为5组：空白对照组(A组),哮喘组(B组),地塞米松组(C组),氟伐他汀组(D组)及氟伐他汀与地塞米松合用组(E组).以10 g/L卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏并长期吸入激发制备慢性哮喘模型.用免疫组织化学方法检测各组大鼠肺组织中增殖细胞核抗原（PCNA）,P21ras和Ⅲ型胶原的表达,采用图像分析方法测量气道壁内周长（Pi）及平滑肌面积（WAm）. 结果：①氟伐他汀对气道重建具有抑制作用: D组的WAm/Pi (4.44±0.95) μm2/μm, Ⅲ型胶原和PCNA表达(32±6, 38±10)均低于B组［(7.01±1.54) μm2/μm, 55±8, 68±12］ (P均<0.05); ②D组对气道重建的抑制作用弱于C组和E组:D组的WAm/Pi, Ⅲ型胶原和PCNA表达均高于C组 ［(3.14±1.06) μm2/μm, 21±6, 26±6］和E组 ［(3.03±0.87) μm2/μm, 20±7, 25±7 ］(P均<0.05); ③D组P21ras表达的吸光度值(24±11)明显低于B组(57±10) (P<0.05). P21ras表达与PCNA (rs=0.685, P<0.05)和Ⅲ型胶原(rs=0.530, P<0.05)的表达分别呈正相关. 结论：氟伐他汀可延缓哮喘气道重建的进程,这种作用与P21ras抑制相关,但其抑制增生的作用弱于地塞米松.

　　【关键词】 氟伐他汀;支气管哮喘;气道重建;癌基因蛋白质p21(ras)

　　0　引言

　　由持续性气道炎症而引发的气道重建是支气管哮喘难以治疗的重要病理基础. 氟伐他汀是一种人工合成的羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethylglutarylCoA, HMGCoA)还原酶抑制剂，已有研究表明其对多种细胞的增殖具有抑制作用［1］，其中包括肺成纤维细胞［2］和气道平滑肌细胞［3］. 这种作用机制可能是通过抑制P2lras(一种由ras基因表达的21KD的膜蛋白)的细胞内定位实现的［1］.本研究采用哮喘大鼠模型,免疫组化方法观察应用氟伐他汀对大鼠肺组织中Ⅲ型胶原沉积, 增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen, PCNA）,P2lras表达,以及对气道壁厚度的影响,并与地塞米松的治疗效果进行比较，旨在了解氟伐他汀对气道重建的抑制作用和这种作用与P2lras之间的相关性.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　SD大鼠50只,雄性,体质量(180±20) g,购自第四军医大学实验动物中心; 卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为美国Sigma公司产品;PCNA,P21ras,Ⅲ型胶原多克隆抗体(兔抗鼠)，链酶素生物素过氧化物酶复合物(SABC), 生物素化的羊抗兔二抗,二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色液均为武汉博士德生物工程有限公司产品;氟伐他汀(商品名：来适可,北京诺华制药有限公司产品)购自第四军医大学西京医院药剂科,规格为40 mg/粒;HPIAS 1000彩色图像分析系统由第四军医大学西京医院病理科提供.

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠哮喘模型的制备

　　按参考文献［4］的方法,在实验当日(0 d)和第7日以OVA 10 g/L 2 mL和100 mg氢氧化铝配成的混悬液大鼠腹腔内注射致敏. 第14日开始用10 g/L OVA超声雾化吸入激发,1次/2 d, 30 min/次,共4 wk,以大鼠出现呼吸加快,口唇发绀,腹肌痉挛,点头呼吸及站立不稳等表现时记为激发成功.

　　1.2.2按不同治疗方法进行动物分组

　　将50只大鼠随机分为空白对照组(A组),哮喘组(B组),地塞米松组(C组),氟伐他汀组(D组)和氟伐他汀与地塞米松合用组(E组) 5组,每组10只. 各组大鼠致敏激发方法同1.2.1.的方法. A组以生理盐水代替OVA腹腔注射及雾化吸入；B组动物在实验当日(0 d)和第7日以OVA 10 g/L 2 mL和100 mg氢氧化铝配成的混悬液腹腔内注射致敏.第14日开始用OVA 10 g/L超声雾化吸入激发,1次/2 d,30 min/次,共4 wk；C组于第14日开始于每次激发前1 h给予腹腔内注射地塞米松0.5 mg/kg；D组大鼠于第14日开始在致敏前0.5 h用氟伐他汀6 mg/kg灌胃；E组于第14日开始在每次激发前1 h给予腹腔内注射地塞米松0.5 mg/kg和致敏前0.5 h氟伐他汀6 mg/kg灌胃.

　　1.2.3HE染色及病理学观察

　　各组大鼠于最后一次激发后24 h内处死.立即取大鼠肺组织用酒精脱水,石蜡包埋切片,厚度为3 μm,苏木精伊红(HE)染色,光镜下观察模型建立情况和气道重建程度.

　　1.2.4P21ras,PCNA和Ⅲ型胶原的免疫组化染色

　　按免疫组化试剂盒说明进行操作：石蜡切片常规脱蜡,酶消化处理,过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶.滴加正常山羊血清封闭液,室温30 min.各组分别滴加1∶200的第一抗体(兔抗鼠P21ras, PCNA和Ⅲ型胶原),4℃过夜.磷酸盐缓冲液(PBS)洗净后,滴加生物素化的羊抗兔IgG,37℃反应20 min,PBS洗净后加链酶素生物素过氧化物酶复合液,37℃ 反应20 min,PBS洗5 min,共4次.滴加DAB显色试剂盒中A,B,C液各1滴,室温显色,镜下控制反应时间(10 min左右),洗净后苏木精复染,树胶封片,一抗以PBS为阴性对照.