喉癌组织中TSLC1基因启动子过甲基化及mRNA表达(1)

【关键词】  TSLC1基因；,,喉肿瘤；,,启动子；,,甲基化

　　Promoter hypermethylation and mRNA expression of TSLC1 gene in laryngeal squamous cell carcinoma

　　【Abstract】 AIM: To explore the relationship between hypermethylation of the promoter of TSLC1 gene and laryngeal squamous cell cancer. METHODS: Promoter hypermethylation and mRNA expression of TSLC1 gene were respectively detected by methylationspecific PCR and RTPCR in normal laryngeal mucosa (n=4) and laryngeal squamous cell cancer (n=40). RESULTS: Among the 40 patients with laryngeal squamous cell cancer, hypermethylation of TSLC1 promoter was seen in 21 cases (52.5％). There was no significant difference in hypermethylation in relation to pathological grade and clinical stage and classification (P>0.05), but a highly significant difference was observed between the patients with and without lymph node metastasis (N0 and N1) (P<0.05). TSLC1 promoter hypermethylation was observed in human laryngeal squamous cell line Hep2. TSLC1 mRNA was not expressed in all laryngeal squamous cell cancers with hypermethylation of TSLC1 promoter and Hep2 cells, whereas it was expressed in normal laryngeal mucosa, polyp of vocal cord and laryngeal squamous cell cancers without hypermethylation. CONCLUSION: Hypermethylation of TSLC1 promoter is associated with loss of its transcription in laryngeal squamous cell carcinoma.The high frequency hypermethylation of TSLC1 promoter illustrates its potential clinical application as tumor marker for diagnosis and prognosis.

　　【Keywords】 TSLC1 gene；laryngeal neoplasms；promoter；methylation

　　【摘要】 目的: 探讨TSLC1基因启动子区过甲基化与喉癌的关系. 方法: 采用甲基化特异性PCR和RTPCR法分析喉部正常粘膜、声带息肉、喉癌细胞Hep2和喉癌组织中TSLC1基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况. 结果: 40例喉癌组织中，有21(52.5％)例TSLC1基因启动子区过甲基化，其在各病理分级、临床分期和分型之间差异无统计学意义(P>0.05)，而在N分级(N0和N1)之间差异有统计学意义(P<0.05). 喉癌细胞Hep2也显示TSLC1基因启动子区过甲基化. RTPCR结果显示，TSLC1 mRNA在所有甲基化的喉癌组织和喉癌细胞Hep2中均无表达，而喉部正常组织，声带息肉组织和非甲基化的喉癌组织中均有表达. 结论: 喉癌组织中TSLC1基因启动子区过甲基化与其mRNA失表达有关，可能是喉癌发生、发展的原因之一，可作为喉癌诊断和预后分析的检测指标.

　　【关键词】  TSLC1基因； 喉肿瘤； 启动子； 甲基化

　　0　引言

　　TSLC1基因(tumor suppressor in lung cancer1)属于免疫球蛋白超家族成员，在组织中广泛表达［1-2］. 已经证实TSLC1甲基化失活与多种肿瘤的发生及预后相关［3-7］. 我们通过观察喉部正常组织、息肉组织、喉癌细胞株Hep2及喉癌组织中该基因启动子区甲基化及其mRNA表达情况，旨在为进一步探讨TSLC1基因启动子过甲基化与喉癌的关系提供理论依据.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1组织标本

　　喉癌患者组织40（男36,女4）例，年龄44～75岁，术前均未行化疗或放疗. 喉部正常组织4例，声带息肉切除组织5例，均来源于第四军医大学唐都医院手术切除标本. 组织切除后立即投入液氮而后转存于-70℃冰箱保存备用. 肿瘤位于声门上16例，声门22例，声门下2例，病理诊断均为鳞状细胞癌. 按1998年TNM分期的标准分期，Ⅰ期:9例，Ⅱ期:12例，Ⅲ期:16例，IV期:3例；N0期:27例，N1期:13例.

　　1.1.2细胞培养

　　喉癌细胞株Hep2(第四军医大学唐都医院中心实验室). 培养于含10 mL/L小牛血清DMEM(美国Gibco公司)的培养液中，37℃，50 mL/L CO2孵箱培养.

　　1.1.3主要试剂和仪器

　　Tris饱和酚购自北京鼎国公司；亚硫酸氢钠购自天津津北精细化工；  氢醌购自上海山浦化工；蛋白酶K购自美国AMRESCO公司；凝胶回收试剂盒购自北京Tiangen公司；TRIzol购于美国GIBCO公司；逆转录酶MMLV为美国GIBCO公司产品；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；PCR仪为Minicycler TMPTC150型，美国Research公司；紫外分光光度仪为UV265W型，美国BECKMAN公司；凝胶成像系统GelBase紫外可见光透射分析仪，美国UVP公司.

　　1.2方法

　　1.2.1DNA提取　　

　　按常规苯酚氯仿异戊醇法提取DNA,紫外分光光度法定量.

　　1.2.2亚硫酸氢钠修饰取1 μg DNA,加入终浓度为 0.3 mmol/L的氢氧化钠溶液,加水至总体积50 μL, 37℃水浴30 min后加入10 mmol/ L氢醌30 μL, 3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL，45℃ 水浴16 h. 应用凝胶回收试剂盒回收DNA,溶于50 μL水中,加入终浓度为0.3  mmol/L的氢氧化钠，37℃水浴30 min终止反应，乙醇沉淀DNA,溶于50 μL水中,备用［7］.

　　1.2.3RNA的提取及RTPCR检测

　　mRNA收集对数生长期培养细胞，细胞密度为1×107或取约50 mg组织用1 mL TRIzol(按说明书操作)逐步提取总RNA. cDNA（complementary DNA)第一链合成体系为25 μL，取总RNA 2 μg，逆转录酶MMLV，oligo寡核苷酸引物(dT)以及相关试剂均按说明书配成适当浓度合成cDNA. 常规PCR扩增TSLC1基因，所用引物如下(合成于北京奥科生物技术公司)： 上游引物:5′CCG GGT TAA GCC TTG TAG AG3′；下游引物: 5′TCA GGT GTT CAA AGG GAA C3′. 内参照选用βactin，上游引物为：5′GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC3′，下游引物为：5′CAA ACA TGA TCT GGG TCA TCT TCT C3′. PCR反应体系为：模板cDNA 2 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol／L dNTP 2 μL，10 μmol／L 引物各1 μL及Taq DNA聚合酶0.5 μL，加水至25 μL，于95℃变性5  min；95℃ 30  s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共计35个循环；72℃延伸10 min. 15 g/L低溶点琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物.

　　1.2.4甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR, MSP)

　　甲基化上游引物(M1): 5′TTT TAA TTA TTT TCG AGT TTA TCG3′, 甲基化下游引物(M2)：5′TCT TTA AAA ACG AAA ACT ATA CG3′；非甲基化上游引物(U1)：5′TTT TTT AAT TAT TTT TGA GTT TAT TG3′，非甲基化下游引物(U2)：5′AAA TCT TTA AAA ACA AAA ACT ATA C3′. MSP反应体系为：模板DNA 2.5 μL, 10×PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol／L dNTP 3 μL，10 μmol／L引物各1 μL及Taq DNA聚合酶0.5 μL，加水至25  μL. 95℃变性5 min；95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 40 s，共计40个循环；72℃延伸10 min. 以正常人外周血淋巴细胞DNA，经甲基化酶SssI处理过的喉癌组织DNA和水，分别做非甲基化、甲基化和空白对照［8］.

　　统计学处理： 用SPSS 10.0软件进行统计学分析， TSLC1基因启动子甲基化与喉癌患者临床病理的关联分析用卡方检验， P<0.05为差异有统计学意义.

　　2　结果

　　2.1RTPCR检测

　　TSLC1 mRNA表达状况正常人喉部组织4例, 声带息肉组织5例以及非甲基化喉癌组织均表达TSLC1 mRNA, 而Hep2喉癌细胞系及甲基化喉癌组织均不表达TSLC1 mRNA(图1).