作者：王凯，温伟红，王涛，张瑞，秦炜炜，雷小英，杨安钢
【关键词】 HER2；,单链抗体；,鱼精蛋白
Construction and expression of human antiHER2 ScFv/Ck/tP fusion protein in E.coli and identification of its activity
【Abstract】 AIM: To construct a fusion protein gene of human antiHER2 ScFv/light chain constant region/truncated protamine (ScFv/Ck/tP) and analyze the binding activity of the expressed protein. METHODS: Two pairs of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the ScFv and the Ck gene. After they were linked as ScFv/Ck, the synthesized tP coding sequence was added in the 3′ terminus of it, then the fusion protein gene ScFv/Ck/tP was cloned into expression vector pET32a and expressed in E. coli BL21 (DE3). Expressed protein was detected by SDSPAGE and Western Blot and purified by NiNTA chelating agarose. The antigenbinding activity of the ScFv/Ck/tP fusion protein was confirmed by cellular ELISA, and the DNA binding ability was confirmed by gel shift assay. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that ScFv/Ck/tP was correctly cloned into expression vector. SDSPAGE and Western Blot analysis showed that ScFv/Ck/tP fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21. Cellular ELISA confirmed that it had specific antigen binding activity; gel shift assay assured that it had DNA binding ability. CONCLUSION: The ScFv/Ck/tP fusion protein expressed in E. coli could specially bind with both HER2 antigen and DNA.
【Keywords】 HER2; single chain antibody; protamine
【摘要】 目的：构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区（Ck）/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性. 方法：设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck)，连接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，连接于ScFv/Ck末端，构建成ScFv/Ck/tP融合基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达产物经SDSPAGE和Western Blot鉴定后，用NiNTA螯合层析介质纯化. 细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性，凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性. 结果：成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性，同时具有结合DNA的能力. 结论：ScFv与Ck，tP融合后，同时具有抗原和DNA结合活性，为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.
【关键词】 HER2；单链抗体；鱼精蛋白
0 引言
HER2是癌基因erbB2/neu的表达产物，在乳腺癌、卵巢癌等多种人类肿瘤细胞中高度表达，是目前公认的肿瘤细胞表面的特异性标志分子［1-2］. 单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)和亲代抗体相比，具有分子小、穿透力强、免疫原性低的特点，日益成为诊断和治疗的良好导向载体 ［3-4］. 鱼精蛋白是一种碱性蛋白，能与核酸结合［5］. 鱼精蛋白截短体(truncated protamine，tP)是一段长22个氨基酸的短肽，它保留了富含碱性氨基酸的序列，同样具有核酸结合功能. 我们将抗HER2 ScFv基因和tP编码序列融合，同时为了避免ScFv和tP之间空间结构的相互影响，在其间插入了一段轻链恒定区编码序列（kappa light chain constant region, Ck），以期获得同时具有抗原和核酸结合活性的ScFv/Ck/tP融合蛋白，核酸与该融合蛋白结合后，在其引导下，有望实现核酸的靶向输送，旨在为该ScFv在HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗的应用中奠定基础.
1 材料和方法
1.1材料
质粒pCMVe23sFvPEIIGrBa［6］，pComb3HFab15，pUC19，pET32a；大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞系SGC7901（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美国Promega公司）；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HiTrap NiNTA螯合层析介质(美国Invitrogen公司)；6 His mAb（德国Qiagen公司）；HRP－羊抗鼠IgG（武汉博士德生物有限公司）；ECL化学发光试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；标准胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）.
1.2方法
1.2.1引物和tP编码序列寡核苷酸的设计与合成
设计扩增ScFv基因的引物 S5： 5′tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3′，S3：5′tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3′，在两端引物中分别引入EcoR I和Xho I酶切位点（下划线部分）. 扩增Ck序列的引物 Ck5： 5′tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3′，Ck3：5′ttttctagactaacactctcccctgttga3′，在两端引物中分别引入Xho I和Xba I酶切位点（下划线部分）. tP编码序列寡核苷酸合成 tP1：5′ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc 3′，tP2：5′tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgctt
cctccgcctcgcgccgg3′，寡核苷酸链的两端带有Xba I和Not I酶切位点的粘端序列（下划线部分），能够直接与经Xba I和Not I酶切的载体连接. 引物和寡核苷酸由北京奥科生物技术有限公司合成.
1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重组表达载体的构建及鉴定
分别以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pComb3HFab15质粒为模板， S5，S3和Ck5，Ck3为引物PCR扩增ScFv和Ck片段，产物经相应的酶切后，一起克隆入pUC19质粒，并进行序列测定，测序正确后的质粒命名为pUC19ScFv/Ck. 将合成的两条tP编码序列寡核苷酸链缓慢退火后，与从pUC19ScFv/Ck质粒用EcoR I和Xba I切下的ScFv/Ck片段一起连接入经EcoR I和Not I双酶切的pET32a载体，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆，酶切鉴定，对酶切鉴定正确的克隆交由北京奥科生物技术有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pET32aScFv/Ck/tP.
1.2.3ScFv/Ck/tP融合基因的诱导表达及鉴定
将鉴定正确的重组质粒pET32aScFv/Ck/tP转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃过夜培养，次日以1∶100接种，37 ℃培养至A600 nm达0.6左右，加入IPTG终浓度为0.5 mmol/L，诱导培养3 h，取5 mL未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以100 mmol/L Tris・HCl (pH 8.0)重悬，超声裂菌后离心，取少量上清加入等量2×SDS上样缓冲液，沉淀重悬于适量1×SDS上样缓冲液，煮沸5 min,离心后取上清进行SDSPAGE分析，凝胶薄层扫描分析蛋白表达情况. 同时对表达产物进行Western Blot鉴定，蛋白样品经SDSPAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜，以5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，依次加入鼠抗6 His mAb（1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜），HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释，室温1 h)，用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.
1.2.4表达产物的分离纯化
取200 mL诱导菌离心后收集菌体，用100 mmol/L Tris・HCl (pH 8.0)重悬，冰浴中温和超声6次（每次2 min，间隔10 s）破碎菌体，4 ℃，10 000 g离心5 min，收集上清过0.45 μm滤膜，用镍次氨基三乙酸(Ni2+NTA)螯合层析介质室温结合1 h，用洗涤缓冲液（100 mmol/L Tris・HCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗涤5次后，分别用含100，200，500 mmol/L的咪唑洗脱缓冲液洗脱. 各取少量不同组洗脱液加入等量2×SDS Loading Buffer，煮沸5 min,离心后取上清进行SDSPAGE分析.
1.2.5表达产物的抗原结合活性检测
采用细胞ELISA的方法. 胰酶消化生长铺满的SGC7901细胞，重悬于含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞密度为5×108/L ，以100 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养24 h， 细胞充分贴壁生长. 40 g/L 多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次. 每孔加入100 μL含30 mL/L H2O2 PBS，室温反应20 min，PBS洗3次. 在细胞包被孔中分别加入不同稀释度的蛋白样品，每孔100 μL，设复孔，阴性对照，37℃孵育1 h，依次加入鼠抗6 His mAb(1∶1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5000稀释）孵育，TMB显色，终止反应后测定各孔A450 nm值.
去辣椒素敏感性窦房结传入神经的大鼠模型的建立
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