双内标PCR(2)

　　2.2检测容量确定

　　在初始模板为10 000拷贝时的差异度最小（1.35％），且8000～10 000拷贝起始量结果有较好的线性关系. 因此，我们将每个PCR反应10 000拷贝定为HS的量.

　　2.3稳定性分析实验得出批内差异为9.48％.

　　2.4双内标PCRELISA定量检测分析

　　合成的三种探针经前期PCRELISA检测，未发现交叉反应. 将已经精确定量、分别为500,1000,2000,5000,7000拷贝的HIV1模板与50拷贝LS，10 000拷贝HS竞争性模板加入同一个PCR管进行扩增并标记. 实验测出三种探针ELISA检测的A值，代入公式计算（表2）. 以实验加入HIV1拷贝数为横坐标，公式计算出来拷贝数为纵坐标，做出标准曲线(图1). 用最小二乘法进行拟合线性模型，线性回归方程的相关系数R2=0.9998，说明公式计算出的HIV1拷贝数与实验加入的HIV1拷贝数这两组变量具有显著的线性关系，其关系用图1中的线性回归方程体现. 在HIV1模板拷贝数较小时（<500拷贝/PCR管）表现出较大的误差. 在误差最小时与已知标准仅差了11.204％（标准在2000拷贝时），平均误差在12.58％.表2双内标PCRELISA定量检测分析结果(略)

　　2.5特异性检测进行PCRELISA检测，结果均无非特异性扩增.

　　3　讨论

　　常规PCR方法30个循环一般需要2～3 h，本实验中所涉及的PCR反应除去引物部分，扩增片段仅60 bp左右，采用“双温法”PCR（94℃变性，50～57℃退火并延伸）可以将反应时间缩短在1 h之内，利用双温PCR法能大大缩短PCR扩增的时间，并且能产生与三步法PCR同样多的产物,有利于在稳定有效的Taq酶活性范围时间内完成反应，从而达到稳定实验结果的目的［6］. 本实验最低检出量为5拷贝，与国内检测水平相近［7］. 在一个PCR体系内，目的片段一般不会超过1012拷贝，即1.66 pmol/L［8］. 实验中采用的110 pM远大于检测产物的量，因此是符合实验条件的.
　　
　　是否设置内参以及恰当的设置是衡量PCRELISA定量效果的一个重要标准. 由于本实验设有两个内参，因此批间差异有可能在内参标准的校正下不影响实验结果. 无内标的PCRELISA只能对目的DNA做定性分析，定量则需在实验中加入内标. 以往国内定量PCRELISA的研究中通常使用单内标方法，但其结果是不同浓度组之间的批间和批内差异都比较大，平均误差在36％左右［9］，如果PCR单一内参照和待测模板起始量相差太大容易造成结果判断不准确. 本实验得出批内差异为9.48％，和国内相关部门所测的9.1％［9］的结果相近. 本实验所采用的双内标法PCRELISA检测目标DNA，因为浓度一高一低的两个内标把PCR管中目的HIV1片段浓度的可模拟范围扩大了. 将已经精确定量、处于50～10 000拷贝之间的HIV1片段与50拷贝LS, 10 000拷贝HS竞争性模板加入同一个PCR管进行扩增，它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记，由于在PCR扩增反应中使用了2个已知浓度内标模板，因此在PCR反应进行过程中每一个PCR反应的试管中任何可能存在的抑制作用和扩增效率都被严密地检测.
　　
　　检测结果表明，我们设计的检测体系能比较准确的测定出初始拷贝在500～7000拷贝的HIV1的拷贝数，如果大于7000拷贝可以将样品进行稀释，小于500拷贝则无法进行精确测定，这点和我们所查国外相关书籍［10］所述类似. 本方法对HIV感染的血样特异性很高，相同拷贝数的检测重复性比较高，但精确度有待提高，特别是对较低拷贝数样本的定量检测出现一些偏离. 由于样本浓度较低，本实验利用连续倍比稀释法对样品进行稀释的过程难免有些误差，这也许就造成了在较低拷贝数的组偏差较大，影响了实验结果的判定. 可以预计，精确浓度的HS，LS标准品的产生将大大提高本实验的精度.
　　本实验利用PCRELISA对HIV1前病毒进行定量检测，其结果为医护人员检出处于HIV感染“窗口期”的患者提供了极大的帮助，也可为患者阶段性用药的效果进行判定. 推而广之，利用该技术可以对其它如乙肝病毒等多种逆转录病毒的前病毒DNA进行定量检测，在临床上有广泛的应用前景.

　　【参考文献】

　　［1］Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(7): 2725-2729.

　　［2］Diviacco S, Norio P, Zentilin L, et al. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates［J］. Gene,1992, 122(2):313-320.

　　［3］Ou CY, Kwok S, Mitchell SW, et al. DNA amplification for direct detection of HIV1 in DNA of peripheral blood mononuclear cells［J］. Science,1988,239(4837):295-297.

　　［4］Korber B, Foley CK. Human retrovirus and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences［M］. Los Alamos, New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1996.

　　［5］郭晏海, 焦凯, 赵锦荣,等. 不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测［J］. 第四军医大学学报, 1999, 20(9): 827-829.

　　［6］Dodson LA, Kant JA. Twotemperature PCR and heteroduplex detection: Application to rapid cystic fibrosis screening［J］. Mol Cell Probes,1991,5(1):21-25.

　　［7］郭晏海, 钟咏梅, 赵锦荣,等. PCRELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用［J］. 第四军医大学学报, 2002,23(22):2086-2088.

　　［8］Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:A laboratory manual［M］.   3ed. Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002.

　　［9］缪晓辉, 戚中田, 孔宪涛. 微量酶联杂交法定量检测HBV基因竞争PCR扩增产物［J］. 中华微生物学和免疫学杂志, 2001, 21(01): 101-104.

　　［10］Francois M. Comparison of competitive PCR and positive controlbased PCR. In: B.Kochanowski and Reischl U, editor. Quantitative PCR protocols［M］. Totowa,New Jersey:Humana Press, 1999:110-111

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