艰难梭菌细胞毒素B功能区的表达(1)

                                    作者：刘红升，张清华，姜泊，蒋知新

【关键词】  艰难梭菌,细胞毒素B；克隆,分子；基因表达

　　【关键词】  艰难梭菌，细胞毒素B；克隆，分子；基因表达
 
　　1材料和方法

　　1.1材料限制性核酸内切酶，T4DNAligase购自New  England Biolab公司. 厌氧发生剂、脑心浸液(干粉)购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌（clostridium difficile, C.d VPI10463）从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株BL21(DE3)及质粒PET22b(+)系南方医科大学消化研究所存.

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因的获得C.d VPI 10463接种于脑心浸液(BHI)培养基中，37℃厌氧环境中透析培养72 h. 碱裂解法提取C.d基因组DNA. 参考Gene bank收录的C.d VPI 10463基因序列，设计引物如：sense:   5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI,  antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′， XhoI.  反应条件：50 μL反应体系，热启动法，94℃变性45   s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39个循环后再延伸10 min. 10 g/L糖凝胶电泳观察扩增结果.

　　1.2.2重组质粒的构建与鉴定将酶切、纯化的目的基因、质粒PET22b(+)按10∶1(摩尔数) 在T4DNAligase作用下16℃连接12 h. 热休克法转化. 挑单个菌落，接种在选择性LB液体培养基中，A600 nm值达0.6，提取重组质粒. 重组质粒的鉴定：用EcoRI与XhoI双酶切鉴定；以重组质粒为模板，进行PCR反应，送上海博亚公司测序.

　　1.2.3目的基因表达阳性克隆菌落接种到2 mL选择性LB培养液37℃, 180 r摇菌致A600 nm为0.6，4℃过夜，然后2%转接LＢ培养液中，培养3 h至A600 nm值为0.8，加IPTG至终浓度为1 mmol/Ｌ，诱导后取样. 产物进行SDSPAGE分析.

　　2结果

　　2.1PCR扩增的目的基因电泳分析发现在1800 bp左右有一条带，大小与预计相符(图1).

　　图1琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ产物 　略

　　2.2重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为PET22b(+)CDB3，电泳初步鉴定结果与预期相符（图2）. 直接以PET22b(+)CDB3为模板进行测序,得到的ＤＮＡ序列，与Gene bank记录的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.

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