Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性(1)

【关键词】  全反式维甲酸

    Molecular cloning of restin gene promoter and its transcriptional activities in HeLa cells

　　【Abstract】 AIM: To clone the promoter and construct its luciferase report vector of our newly found gene restin and to analyze its response to the stimulation with alltransretinoic acid (ATRA). METHODS:  Approximate 2000 bp up from the ATG of gene restin was bioinformatics analyzed with computer. The fragment was generated by polymerase chain reaction and cloned the upstream of luciferase report gene into plasmid pG5luc, replacing the five GAL4 binding sites and adenovirus promoter to generate the plasmid Rpluc. Rpluc was transfected into HeLa cells and luciferase activities were measured with or without the treatment of ATRA at indicated time. RESULTS:  We successfully cloned and identified the promoter of the gene restin and constructed its luciferase report plasmid. Obvious response to ATRA was found when transfected into HeLa cells and a high expression of luciferase was detected when induced with ATRA. CONCLUSION:  The luciferase report system of restin gene promoter we have constructed can be applied for further study of the function and transcriptional regulation of restin.

　　【Keywords】 restin；transcription regulation；promoter；alltransretinoic acid

　　【摘要】 目的：扩增细胞静息因子(restin)基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统，探讨其对全反式维甲酸(alltrans retinoic acid, ATRA)刺激的反应. 方法：①对restin基因上游约2000 bp基因组序列进行计算机生物信息学分析. ②利用PCR技术扩增restin基因上游序列，将其克隆入pG5luc中，插入荧光素酶报告基因上游，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，构建Rpluc质粒. ③将构建的质粒转染入HeLa细胞，ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达. 结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列，已将该序列插入到荧光素酶基因的上游；ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rpluc，荧光素酶表达明显增加. 结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统，为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础.

　　【关键词】 restin；转录调控；启动子；全反式维甲酸

　　0引言

　　细胞静息因子(restin)基因是在全反式维甲酸（alltrans retinoic acid, ATRA）诱导的肿瘤细胞中差异表达的基因之一（Genbank登录号:  NM_014061），属于黑色素瘤相关抗原（melanoma associated antigen，MAGE）家族，将其导入白血病细胞可以抑制细胞增殖［1-2］. 路凡等［3］认为可以将MAGE家族分为酸性MAGE蛋白和碱性MAGE蛋白. 有意义的是碱性MAGE蛋白在终末分化细胞和生殖细胞中表达，而在肿瘤细胞中不表达或低表达，而酸性MAGE蛋白则在终末分化细胞中不表达，只表达在肿瘤细胞和生殖细胞中. 同时在ATRA诱导的肿瘤分化细胞中，表现出酸性MAGE蛋白降低和碱性MAGE蛋白升高，restin正好也为碱性MAGE蛋白. 组织表达谱分析表明restin主要表达在正常终末分化组织，而在肿瘤组织中不表达或表达量极低［4］. 因此，研究restin的表达调控不但可以增强对restin的作用机制的理解，同时也可促进对肿瘤细胞分化控制机制的了解. 我们根据生物信息学分析结果的提示，从胎儿肌肉基因组DNA中扩增得到含预测启动子区和调控元件restin基因翻译起始位点上游约2000 bp DNA序列，并利用KpnI 酶切位点和NcoI酶切位点将扩增序列导入荧光报告载体pGL5Luc中，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，然后将构建好的质粒转入HeLa细胞中检测ATRA诱导前后转录活性，为研究该基因的转录调控及功能奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　大肠杆菌菌种DH5α和HeLa细胞为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；限制性内切酶、pyrobest酶、pMD18T Vector（宝生物工程公司）；脂质体Lipofectamine 2000及1640培养基（Invitrogen公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；DL2000 marker（华美生物工程公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒超纯去内毒素质粒提取试剂盒（Vgene公司）；E.Z.N.A TM 组织DNA提取试剂盒（Omega公司）；ATRA（美国Sigma公司）；双荧光报告系统及照度计TD20/20检测仪（Promega公司）；寡核苷酸引物合成及测序由三博生物技术公司完成.

　　1.2方法

　　1.2.1restin基因5′端上游序列的生物信息学分析利用NCBI基因组数据库查找restin基因5′端上游序列，使用McPromoter promoter prediction server软件进行启动子预测，Vector NTI分析部分转录因子结合位点(100%匹配).
1.2.2引物设计与合成设计引物：上游引物引入KpnI酶切位点5′ac ggt acc gcc cta cgt ttg aga tta agt cgc3′, 下游引物引入NcoI酶切位点5′cga gcc atg gct cct gat aga ggc tc3′.

　　1.2.3基因组DNA提取提取人胎儿股部肌肉组织基因组DNA，按照试剂盒提供的操作手册进行操作.

　　1.2.4PCR扩增启动子提取的基因组DNA稀释10倍后取1 μL作为PCR反应模板，反应体系为：引物400 nmol/L，dNTP 200 μmol/L, pyrobest酶1 U; 反应参数为：95℃ 30 s, 58℃ 20 s, 72℃ 120 s, 30个循环.

　　1.2.5PCR扩增产物的克隆及鉴定扩增产物经试剂盒纯化回收，再用Taq酶1 U，dATP 200 μmol/L，72℃ 30 min加入多聚A尾, 产物琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将片段连入pMD 18T Vector载体（4℃过夜），转化. 以上过程均参照文献［5］进行，转化的菌液铺制在含IPTG和Xgal的Amp抗性的LB琼脂平板上培养，利用α互补原理，通过蓝白斑筛选出重组子. 经 KpnI 和 NcoI双酶切鉴定出有插段的阳性克隆及方向. 挑选阳性克隆提取质粒，做测序反应.

　　1.2.6荧光报告质粒Rpluc的构建KpnI和NcoI双酶切pG5luc质粒的GAL4 结合区域，将测序结果正确的片段与pG5luc连接，构建荧光报告质粒Rpluc.

　　1.2.7荧光报告系统转录活性检测含2 mmol/L谷氨酰氨和100 mL/L FBS的1640培养液常规培养HeLa细胞. 在转染前1 d将细胞接种于24孔板，37℃, 50 mL/L CO2孵箱培养细胞至次日80%~90%铺满时进行转染. 每孔转入质粒Rpluc 0.8 μg; pBind 0.01 μg. 转染4～6 h后，换为含1×10-6 mol/L ATRA的完全培养基继续培养，以不加ATRA者作阴性对照.