Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性(2)

　　1.2.8荧光素酶的检测继续培养24 h后小心吸去孔中的培养基，加入足量的PBS洗涤培养孔，每孔中加入100 μL 1×PLB（Passive lysis buffer, 裂解液），室温摇动孵育15 min，充分溶解转染细胞, 吸取细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中，13 000 g离心5 min, 吸取上清液. 按照双荧光报告系统的说明书进行操作，分别检测得到萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光值，二者的比值即为相对荧光表达量，代表启动子的活性. 每组实验至少重复3次，取平均值.

　　2结果

　　2.1转录因子结合位点和启动子预测结合文献报道的与凋亡和ATRA相关的转录因子的结合位点，对restin基因上游序列进行比对分析发现：该序列中含有一个p53结合位点aagacaagctt和一个C/EBP结合位点ttgcttaa；三个GAS（STAT）结合位点,依次是ttcctggaaa，ttctcagaat，ttccaagaat. 启动子预测分析发现restin基因上游2000 bp存在三个可能的启动子区.

　　2.2荧光报告质粒构建以提取的基因组DNA为模板，扩增出restin基因上游序列，大小为2170 bp,克隆入pG5luc载体，命名Rpluc. 酶切鉴定如图1所示.

　　2.3荧光报告系统转录活性检测ATRA刺激转染荧光报告质粒Rpluc的Hela细胞后，荧光素酶活性测值明显增加，表明所构建的restin基因启动子报告系统有转录活性（图2）.

　　3讨论

　　随着新基因不断被发现，目前已知的基因数量越来越多，在对新基因结构与功能的研究中，最重要的内容之一就是基因的表达调控. 阐明基因表达调控的机制，不但可以深入了解疾病发生的原因，而且对于基因治疗的研究也具有十分重要的意义. 启动子区的克隆是对基因表达调控进行研究的必要条件，通过启动子研究，许多新基因功能及其在信号传导中的地位渐被认识（如新基因IRS3转录起始位点的确定［6］，caspase8转录水平调控的发现［7］及转录因子p53与FAK基因相互关系［8］等）. restin基因是ATRA诱导肿瘤细胞分化克隆得到的差异表达基因之一，该基因的表达特征和表达水平是如何受到调控的值得深入研究.

　　克隆新基因的启动子是对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要. 对于已知基因序列清楚的情况下首先采用的就是PCR法. PCR法的主要优点是简便、快捷、操作简单；其缺点是只能扩增两端已知序列间的DNA区，且扩增的特异性较低. 其适用条件是建立在对基因序列十分清楚的基础上，只有知道基因的全序列，才可根据已知序列设计引物，扩增出该基因的启动子. 设计引物之前，应用生物信息学的方法通过软件预测，对 restin基因翻译起始位点上游约2000 bp DNA序列进行分析，结果发现其中含三个可能的启动子区域，以及p53，C/EBP，STAT等转录因子的结合位点. ATRA是经典的诱导肿瘤细胞分化剂，restin是通过ATRA分化诱导的差异表达基因，我们选择了荧光报告载体构建了带有restin基因启动子的荧光报告质粒(Rpluc)，确定该报告系统在ATRA诱导分化的HeLa细胞中有转录活性，并且可以作为研究restin基因转录调控的重要工具；我们的研究结果证明该构建启动子报告系统的方法是可行的, 为研究其他新基因的启动子转录调控机制提供了一种准确可靠的荧光报告系统的构建方法，并且该启动子的转录活性受ATRA调控. 为下一步研究不同截短体启动子区域的活性和确定转录调控结构域、深入研究转录调控机制奠定了基础.

　　【参考文献】

　　［1］ Zhao ZL, Huang X, Li N, et al. Direct cloning of cell differential expression genes with fulllength by a new strategy based on the multiple rounds of "long distance" PCR and magnetic beads mediated subtraction ［J］. J Biotech, 1999, 73: 35-41.

　　［2］  Zhu F, Yan W, Zhao ZL, et al. Improved PCRbased subtractive hybridization strategy for cloning differentially expressed genes ［J］. J Biotech, 2000, 29(2): 310-313.

　　［3］ 路凡，杨辉，王孝功，等. 碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(3): 309-311.

　　［4］  Zhao ZL, Lu F, Zhu F, et al. Cloning and comparative biology study of Restin, a novel member of MAGE superfamily ［J］. Sci China (Series C), 2002, 45(4):412-420.

　　［5］  Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(金东雁，黎孟枫译). 分子克隆实验指南 ［M］. ２版. 北京: 科学出版社,1992: 16-68.

　　［6］  Salvtore S, Anrea O, Luca L, et al. Cloning of the mouse insulin receptor substrate3 (mIRS3) promoter, and its regulation by p53 ［J］. Mol Endocrinol, 1998, 16(7):1577-1589.

　　［7］  Kong XT, Gao HX, Eric J. Mechanisms of differential activation of target gene promoters by p53 hinge domain mutants with impaired apoptotic function ［J］. J Biol Chem, 2001,(276): 32990-33000.

　　［8］  Golubovskayaa V, Kaura A, Cance W. Cloning and characterization of the promoter region of human focal adhesion kinase gene: Nuclear factor kappa B and p53 binding sites ［J］. Biochim Biophys Acta, 2004, 1678(23):111-125.

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