大鼠重型颅脑创伤后COX2蛋白表达对学习记忆功能的影响(1)-找论文网

作者：张涛朱军刘清军李建民付爱军

【摘要】 　　目的：观察大鼠重型颅脑创伤后COX2的表达及选择性COX2抑制剂NS398对大鼠重型颅脑创伤后学习记忆功能的影响. 方法: 采用Marmarous方法建立大鼠重型闭合性颅脑创伤模型, 将成年Wistar大鼠360只随机分为脑创伤组、NS398治疗组、假手术组,每组又分为伤后1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168及336 h 10 个时相组,另取120只作为正常对照组. NS398治疗组经致伤后, 给予腹腔注射NS398 40 mg/(kg·d), 直至各时相点处死; 脑创伤组、假手术组及正常对照组在相同时间给予等量的生理盐水腹腔注射. 各组均在相应的时间点处死取材应用Western Blot方法及免疫组化法检测COX2蛋白变化. 再取24只大鼠随机分为脑创伤组、NS398治疗组、假手术组及正常对照组,进行水迷宫测试. 结果: NS398能够使大鼠脑内COX2蛋白表达高峰明显下调,使水迷宫测试的潜伏期明显缩短. 结论:提示COX2与脑创伤后引发的继发性脑损伤密切相关， NS398能够明显改善大鼠重型颅脑创伤后学习记忆障碍.

【关键词】 颅脑损伤环氧合酶2 抑制剂NS398 Morris水迷宫大鼠

0引言

颅脑损伤后的继发性因素是造成脑损伤发生、发展的重要原因，其中炎症是脑创伤病理生理过程中的一个重要组成环节. 环氧合酶2（COX2）是花生四烯酸代谢的限速酶,后者产生的前列腺素及血栓素是脑创伤后炎症级联反应的重要介质. 本实验我们应用Western Blot法，免疫组化法，观察应用选择性COX2抑制剂NS398后大鼠脑内COX2蛋白表达变化及Morris水迷宫测试其对脑创伤后学习记忆的影响.

1材料和方法

1.1材料实验动物取480只健康成年雄性Wistar大鼠(河南医科大学实验动物中心提供. 动物合格证号为医动字第410117号), 体质量300～350 g, 随机分成脑创伤组, NS398治疗组,假手术组及正常组，每组120只，分别用于Western Blot(60只)及免疫组化法(60只). 每组又分为伤后1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168及336 h 10个时相组. 另取24 只大鼠随机分为脑创伤组、NS398治疗组、假手术组及正常对照组,每组6只，进行水迷宫测试.

1.2方法

1.2.1大鼠模型制备动物用100 mL/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,参考Marmarous方法［1］造成大鼠重型弥漫性颅脑创伤,致伤高度2 m,致伤物质量450 g. 伤后给予动物人工辅助呼吸及伤口清创缝合. 假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合,但不致伤. 正常对照组不做任何处理.

1.2.2给药NS398纯标准品由美国Neuomarker公司提供, NS398治疗组于伤后即刻给于(40 mg/ kg)腹腔内注射一次，以后给药1次/d, 直至各时相点处死,同时脑创伤组、假手术组及正常对照组给于等量的生理盐水腹腔注射.

1.2.3免疫组化检测于上述伤后各时相点,对动物用100 mL/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，开胸, 40 g/L多聚甲醛经心灌流固定10 min后,取出脑组织,置于40 g/L多聚甲醛后固定12～24 h (4℃). 取出固定液中脑组织标本,常规脱水、石蜡包埋. 冠状面连续切片,厚度约4 μm,经黏片剂处理过的载玻片捞片,置于60℃烤箱烘烤1 h后, 严格按试剂盒说明操作,一抗为兔抗鼠COX2 mAb（天津灏阳生物技术有限公司提供）. 每次实验均设阴性对照,以PBS代替一抗. 胞质有棕褐色颗粒者为COX2阳性细胞.

1.2.4Western Blot技术检测蛋白质的表达动物断头后1 min内小心取出新鲜脑组织，经不同处理后,置于4℃预冷细胞裂解液中, 低温离心后,保留上清, 采用考马斯亮蓝（CBB）G250蛋白定量法［2］测定蛋白质浓度. 等量蛋白质在120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳后,转移蛋白质至硝酸纤维素膜上, 用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h, 用鼠mAb COX2抗体(1∶100)在10 g/L的脱脂奶粉中4℃过夜. 再加入封闭液稀释的二抗(稀释度1∶500)室温1 h; DAB显色: TBST漂洗液漂洗3次，每次20 min于脱色摇床上，加入双蒸水10倍稀释的DAB显色约10 min，见有清晰条带出现即用PBS终止显色,扫描并以CMIAS真彩色医学图像分析系统软件进行定量分析.

1.2.5Morris水迷宫测试严格按照Smith等［3］的方法,取24只大鼠随机分为脑创伤组、NS398治疗组、假手术组及正常对照组,于伤后7, 8, 9, 10 d进行学习记忆功能测试.

统计学处理: 实验数据用x±s表示，使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验. P<0.05为有统计学意义.

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