【关键词】 乙酰肝素酶
Construction and identification of eukaryotic expression vector expressing double shRNA sections targeting heparanase gene
【Abstract】 AIM: To construct and identify eukaryotic expression vector expressing double shRNA sections targeting heparanase gene (HpashRNA). METHODS: Six pairs of oligonucleotides were designed and chemically synthesized. After randomly connecting an oligonucleotide and another one with 4-8 bases pairs interval, they were directionally inserted into plasmid pGenesil1 with respectively U6 promoter and termination code, the common green fluorescence protein (EGFP) gene and Neo gene. In this way, 3 vectors of pGenesil1HpashRNA containing 2 sections of HpashRNA were constructed and they were transfected into the ovarian cancer cell SKOV3. The rate of transfection was detected by flow cytometry and fluorescence microscope. The inhibition effectiveness of Hpa protein was analyzed by immunohistochemical staining. RESULTS: The constructed eukaryotic expression vectors effectively suppressed the Hpa expression in transfected cells. The 3 vectors of different short hairpin RNA of Hpa effectively suppressed the expression in SKOV3（P<0.01）. CONCLUSION: We have constructed a eukaryotic expression vector of shRNA, specific for Hpa and have constructed and identified a eukaryotic expression vector of doublegene short hairpin RNA for Hpa.
【Keywords】 heparanase; U6 promoter; shRNA; eukaryotic expression vector
【摘要】 目的： 构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶(Hpa)特异性基因真核表达载体. 方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链，经退火、连接和磷酸化后得到HpashRNA双链，将两两随机间隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的Ｕ6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）基因和Neo基因的pGenesil1中，构建3 条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil1HpashRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3，流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率，免疫组化分析Hpa蛋白表达. 结果：酶切与测序证实pGenesil1HPSEshRNA构建成功,无任何碱基突变，3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化，3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别. 结论： 构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil1HpashRNA.
【关键词】 乙酰肝素酶; U6启动子; 短发夹RNA; 真核表达载体
0引言
在整体或细胞水平转移外源基因进行遗传学改变、修饰是目前基因治疗的重要方式. 基于此理的RNA干扰(RNA interference, RNAi)通过采用一小段RNA(small interference RNA, siRNA)特异性地关闭特定基因使之“沉默”,失去其功能以达到相应治疗作用成为基因治疗新的靶点［1］. 但低效率的基因转移过程通常是基因治疗的瓶颈, 通过构建多基因共表达载体成为解决这一问题的策略之一. 乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）是近几年逐步明确的参与肿瘤转移过程的葡萄糖醛酸酯酶，可降解细胞外基质中的乙酰肝素蛋白聚糖，破坏基质网络状结构，使膜的功能降低，更易于肿瘤组织扩散［2 ］. 为此，我们通过自行设计并构建包含两段HpashRNA的、携带有各自的Ｕ6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）基因和Neo基因的pGenesil1HpashRNA载体,利用质脂体介导的方法转染卵巢癌细胞株SKOV3，分析RNAi对Hpa基因表达抑制作用，探讨多基因共表达的增效可能.
1材料和方法
1.1材料
线性化的质粒载体pGenesil1（武汉晶赛生物公司）；工具酶（日本TaKaRa公司）；质粒提取盒（中鼎公司）；METAFECTENE转染试剂（德国Biontex公司）；dsDNA片段（武汉晶赛生物工程公司化学合成）；山羊抗人Hpa多克隆抗体（Santa Cruz公司）；SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（棕色）（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1发卡样Hpa基因（HpashRNA）设计根据GenBank提供的Hpa基因cDNA序列,通过基因Blast验证,挑选6条长各为21个碱基的特异性寡核苷酸序列5′ GTACTTGCGGTTACCCTAT ３′; 5′ GCTTCGTACCTTGGCCAGA ３′; 5′ TTGCTACTCCGAGAACACT ３′; 5′ TGGGTCGCAGTTAGGAGAA ３′; 5′ GGAAGCTTCGAGTATACCT ３′; 5′ GCTTCGAGTATACCTTCAT ３′. 分别在5′和3′端引入BamH I和Hind III酶切位点,按如下结构BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+Sac I/EcoR I/Sac I/Sal I/Sal I/Xba I+Hind III化学合成有发卡样结构的shRNA寡核苷酸单链,同时合成互补链.
1.2.2pGenesil1HpashRNA的构建用50 μL annealing buffer溶解上述单链目的基因片段. 各取2 μL单链+16 μL annealing buffer，94℃退火自然冷却至室温. 用双链退火连接后再磷酸化的退火片段分别与线性化Pgenesil1载体连接，22℃水浴反应过夜,构建的阳性克隆命名为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3）.
1.2.3pGenesil1HpashRNA扩增及纯化各取5 μL连接产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜. 各挑取3个单克隆菌落接种于3 mL含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜. 收集菌液,小量快速抽提质粒DNA,15 g/L琼脂糖凝胶电泳，部分菌液送上海申友公司测序.
1.2.4细胞转染及表达鉴定提取3种重组质粒，并进行DNA定量. SKOV3细胞生长到占瓶底约80%～90%时，分为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3）及非特异性shRNA片段对照4组，按照METAFECTENE转染试剂盒操作方法转染，以含800 mg/L G418的RPMI 1640培养液培养4 wk，筛选阳性克隆. 荧光显微镜观察EGFP的表达并照相.
1.2.5流式细胞仪检测转染效率将1×107/L的培养细胞用2.5 g/L胰酶消化，PBS清洗,上流式细胞仪（美国BO公司，FACSealiber)检测,激发光为488 nm,接收光为530 nm. 用Cellquest软件进行数据获取与分析.
1.2.6免疫组化染色检验细胞Hpa蛋白表达细胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色. 胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片在400倍显微镜下随机计数300个细胞. 阴性（－）：不着色；阳性（+）：细胞质内有细小稀疏黄色颗粒；（）：细胞质内有较密的细小黄色颗粒；（）：细胞内有明显的细小黄色颗粒. 将结果按下面公式计算. 细胞Hpa蛋白表达积分＝（+）%×1+（）%×2+（）%×3.
2结果
2.1pGenesil1HpashRNA重组质粒的构建重组质粒用BamH I做酶切鉴定,阳性克隆产生400 bp的片段. 证实已将合成的DNA片段成功插入载体pGenesil1中（图1）.
2.2测序分析经测序结果证实3个质粒构建部分的碱基序列与设计DNA片段完全一致，碱基无突变. 表明已成功构建含两段目的shRNA片段的重组质粒载体.
2.3转染效率稳定转染4 wk后，荧光显微镜下发现转染后经G418筛选出的阳性克隆荧光表达强烈、稳定，经消化传代后仍有较强表达，表明质粒已成功转入细胞中（图2）.
2.4流式细胞仪检测转染效率非特异性对照组细胞荧光表达率为67.58%，pGenesil1HpashRNA（1）为65.23%，pGenesil1HpashRNA （2）为78.63%，pGenesil1HpashRNA（3）为68.56%，达到常规实验要求.
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