2.3TH免疫细胞化学观察按照常规SABC方法进行TH免疫细胞染色，显示TH阳性反应的是中脑DA能神经细胞，在显微镜下比较神经细胞的形态及反应程度，将各组随机选取40个孔，对标本进行TH阳性细胞记数并进行统计学处理，发现经不同剂量EGB761处理的TH阳性细胞数目均明显高于MPP＋组（P<0.01），NGF组TH阳性数也显著高于MPP+组(P<0.01). 大剂量EGB761组与NGF组比较TH阳性数无统计学差异（P>0.05）. EGB761与NGF均能降低MPP+对DA能神经元的损伤（表2）.表2不同处理因素下胚胎大鼠中脑原代细胞iNOS, TH阳性细胞数水平(略)
2.4iNOS免疫细胞化学观察按照常规SABC方法进行iNOS免疫细胞化学染色，将各组随机选取30个孔，对标本进行iNOS阳性细胞记数并进行统计学处理，发现MPP＋组iNOS表达显著高于对照组、EGB761各组及NGF组（P<0.01）. 提示EGB761与NGF对MPP+损伤的神经细胞均有保护作用（表2）.
3讨论
D的特征性病理改变是中脑黑质纹状体多巴胺能神经元的变性、坏死，导致DA能神经元数量的减少. 研究发现，左旋多巴对体外培养的神经元有促凋亡作用［3］. 现代药理学研究发现，EGB761能够清除自由基并能够抑制自由基的产生，降低病损细胞凋亡速度［4］ ,还可减少脑组织耗氧量，具有保护脑神经细胞膜的功效［1］. 但EGB761对体外培养的中脑原代细胞的作用少见报道. 体外神经细胞培养作为研究在体细胞的神经模型之一，具有安全性、重复性较好，影响因素较少，条件比较单一等优点. 而中脑原代细胞的培养与一些DA能细胞株（PC12，SHSY5Y，MES23.5）相比，更接近生理条件，能更好的模拟机体内环境. MPP+是线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的可逆性抑制剂，能使细胞内ATP和GSH减少，破坏钙离子平衡，导致呼吸链产生自由基增多，引起多巴胺能神经元变性死亡［5］. 因此，本实验采用体外培养胚胎大鼠中脑原代细胞来观察EGB761对MPP+损伤的中脑原代细胞中DA能神经元的作用.
TH染色阳性细胞是DA能神经细胞功能存在的标志［6］. NO是一种自由基，也是一种信使分子，可通过多种途径作用于细胞凋亡通路. Liu等［7］研究发现，NO可以抑制细胞DNA合成，反应产物亚硝酸根离子（ONOO-）通过氧化和硝化作用选择性破坏蛋白质，如TH和αsynuclein，并可使DNA烷化，消耗ATP，最终导致神经细胞凋亡. BalPrice等［8］也发现NO可通过线粒体的损伤诱导PC12细胞凋亡. NOS有原生型（eNOS）和诱导型（iNOS），前者主要调节生理功能，后者在病理状态下产生，我们采用免疫细胞化学染色技术检测中脑原代培养细胞中iNOS的表达，并观察到EGB761可以明显降低MPP+损伤后iNOS的表达，从而降低NO的产生和细胞的凋亡. NGF是某些交感神经元和感觉神经元存活和发育所必须的生长因子，具有内源性神经保护和修复功能［9］. 在本实验中NGF发挥了对中脑原代细胞的保护作用.
本研究结果显示，EGB761可提高体外培养的胚胎大鼠中脑原代细胞的活性，并可能促进DA能神经生长，且能降低iNOS的表达，对抗细胞凋亡. 但其作用机制尚不明确，可能是通过降低NO的产生，部分阻断自由基产生的异常信号通路而减少细胞凋亡, 也可能是通过营养星形胶质细胞［10］促其合成神经营养因子，而起到对中脑原代培养细胞的营养作用. 总之，本研究发现EGB761可增加体外培养的DA能神经元活性，且其作用有剂量依赖性趋势，为EGB761防治PD提供了实验依据.
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