供体淋巴细胞在GVHD模型小鼠组织器官中迁移和分布的动态观察(1)

            作者：温宏升，王健民，周虹，夏荣，邱慧颖，高磊，胡晓霞

【摘要】  本研究应用小鼠GVHD模型探讨异基因T淋巴细胞在移植受体体内的迁移和分布。将C57BL/6 的骨髓细胞和转基因荧光C57BL/6 小鼠的脾淋巴细胞输入经8 Gy全身照射的BALB/c小鼠，建立eGFP 标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型；应用荧光显微镜和流式细胞术观测GVHD模型中eGFP+细胞的分布；ELISA法检测GVHD靶组织中趋化因子MIP-1α水平的改变。结果表明：①输入脾细胞和骨髓细胞第8天后出现GVHD临床及病理表现;②GVHD模型中，受体鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP+ 细胞浸润;③GVHD小鼠肝、脾eGFP+ 细胞中CD4+ 、CD8+ 细胞比例均逐渐升高;④GVHD鼠脾、肝组织中MIP-1α水平升高，脾中MIP-1α水平高峰出现于移植后第3天，肝中MIP-1α水平高峰出现于移植后第7天。结论：除肝、肠、皮肤外，肺、舌可能也是GVHD靶器官。肝、脾组织中供体淋巴细胞浸润伴随MIP-1α水平的升高。

【关键词】  小鼠GVHD模型; T淋巴细胞；增强型绿色荧光蛋白；巨噬细胞炎症蛋白

　　Migration and Distribution of Allogeneic T Lymphocytes in  Organs of  Graft-Versus-Host Disease Mouse  Model

　AbstractThis study was aimed to  investigate the migration and distribution processes of allogeneic donor T lymphocytes in the organs of recipient mice.  GVHD model was established by transfusion of the splenocytes of eGFP transgeneic C57BL/6 mice together with born marrow cells harvested from  C57BL/6 mice into BALB/c mice underwent 8.0 Gy total body irradiation. The migration and homing of eGFP+ cells were tracked by stereo-fluorescent microscopy or inverted fluorescent microscopy and  flow cytometry. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed on supernatants from the tissue  homogenates to detect the amount of MIP-1α. The results indicated that GVHD clinical manifestation and pathological changes of organs appeared on day 8 post transplantation.  eGFP-positive donor T cells in recipient organs were  observed by inverted fluorescence microscope in frozen section, or by stereo-fluorescence microscopy in living organs, such as liver, spleen, skin, lungs, bowels, and tongue.  The highest expression of MIP-1α  was on day 7 post transplantation in the liver (491.3±32.1 pg/ml), and day 3 post transplantation in the spleen (881.5± 45.2 pg/ml)，respectively (P<0.05).  It is concluded that  GVHD was induced by splenocytes of eGFP transgeneic C57BL/6 mice. eGFP+ cells in the organs can be observed by fluorescent microscopy. In this GVHD model, donor T cells proliferate and infiltrate in liver, skin, bowels, as well as lungs and tongue.  MIP-1α  may be in  relation  with  the infiltration of T lymphocytes in  liver and spleen.

　　Key wordsmurin GVHD model;  T lymphocytes; splenocytes;  enhanced green fluorescence protein;  macrophage inflammatory protein-1（MIP-1α）

　　移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的主要并发症之一。目前公认GVHD是由供体T淋巴细胞在宿主体内被激活,并攻击靶组织所引起，但对异基因T淋巴细胞在受体体内的迁移、组织分布及激活过程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范围也存在一定争议。我们建立了增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, eGFP) 标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型，观察了GVHD模型中eGFP+ T淋巴细胞的分布与激活，为GVHD防治研究提供基础资料。

　　材料和方法

　　实验动物

　　BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、 C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均为6-8周龄，购自上海生命科学院实验动物中心。eGFP-Tg- C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周龄，由第二军医大学细胞生物学教研室提供。

　　实验材料

　　PE labeled anti-mouse CD4，PE-cy5 labeled anti-mouse CD8 为Biolegend 公司产品。小鼠MIP-1α ELISA检测试剂盒为R&D公司产品。

　　供体小鼠骨髓、脾细胞悬液的制备与检测

　　颈椎脱位法处死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，无菌取其双侧的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI 1640培养液制备骨髓细胞悬液及脾细胞悬液。以PBS重悬细胞，调整浓度至107/ml。0.4%台盼蓝染色提示骨髓细胞悬液及脾细胞悬液中活细胞在95％以上。流式细胞术检测骨髓细胞和脾细胞中CD4+  T、CD8+ T淋巴细胞百分比。

　　GVHD模型的建立

　　用60Co-γ线 全身照射受体BALB/c 雌性小鼠(8.0 Gy,剂量率为0.5 Gy/min)，于6-12 小时内每只鼠经尾静脉输入8×106骨髓细胞(BMC)+15×106脾细胞(SC)。分组如下： A组18只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMC + eGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B组5只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMC；C组BALB/c鼠5只，输eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMC+ C57BL/6鼠SC。

　　造血重建

　　移植后第1、3、 5、11、13天，检测外周血细胞数。移植后第13天，制备骨髓细胞悬液片，在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察。骨髓细胞悬液染色体检查采用短期培养法，显微镜下计数Y染色体的分裂相比例，共观察10个分裂相。

　　GVHD观察

　　死亡时WBC<0.5×109/L为移植失败，WBC>1.0×109/L并具有以下症状者为GVHD 发生:倦怠、纳差、体重减轻、弓背、乱毛、脱毛、腹泻甚至死亡。以25天为观察期限，观察小鼠的GVHD发生情况和生存时间。取肝、肠、皮肤组织,用4%中性甲醛固定,石蜡包埋，常规切片,HE染色,光学显微镜下观察。

　　eGFP+ 淋巴细胞在小鼠体内的分布

　　取A组小鼠，麻醉后，去毛，切开鼠胸腹部，暴露肝、脾、肠、肺、肾，皮肤、舌、脑、骨等。用Leica MZFLⅢ 立体荧光显微镜观察，拍照，曝光时间0.4-1.9秒。取A组小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、单个肾脏、肠、皮肤、肺、脑实质、舌、肾脏等，冰冻切片（厚10 μm），在Olympus Ⅸ 70倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。以未输入eGFP细胞小鼠的各组织及冰冻切片分别作对照，排除背景荧光。

　　MIP-1α水平和T细胞亚群检测

　　取肝、脾、单个肾脏，置于200目不锈钢网中轻轻碾碎，以1 ml PBS分别收集细胞，   500×g 离心 6分种，取上清，行MIP-1α  ELISA检测，按试剂盒说明书操作，测450 nm OD值。采用Curve Expert1.3 软件作标准曲线，计算样本OD值对应的浓度值。流式细胞术检测肝、脾、肾细胞悬液中eGFP+ 细胞百分数及以eGFP+ 细胞设门的CD4+、CD8+ 细胞百分数。

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