作者：陈惠芹，张绪超，唐新意2，吴北燕，黄绍良
【摘要】 本研究检测人胚胎主动脉－性腺－中肾（AGM）区基质细胞表达的造血生长因子，为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞（hAGMS1-S5）的表达情况，应用ELISA法测定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5细胞培养上清液中的分泌水平，并将脐血CD34＋细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明： hAGMS1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Flt3-L、IL-6等因子，hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异（P>0.05）。集落培养结果表明，hAGMS1-S5对CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用， hAGMS1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异（P<0.05），其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5。结论： 人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子，这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。
【关键词】 主动脉－性腺－中肾区；基质细胞；造血生长因子
Hematopoietic Growth Factors Expressed in Human Aorta-Gonad- Mesonephros (AGM)-Derived Stromal Cells in vitro
AbstractThis study was aimed to investigate the hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros (AGM)-derived stromal cells in vitro in order to provide the basic data for elucidating the role of AGM -derived-stromal cells in embryo-hematopoiesis and its hematopoietic suppoitive effect. RT-PCR was used to analyze the expression of IL-6, SCF, Flt3-L, oncostatin M(OSM), IL-3, TPO, M-CSF and LIF in human aorta-gonad- mesonephros-derived stromal cells (hAGMS1-S5) at mRNA level. IL-6, SCF and Flt3-L levels were detected in the supernatant of hAGMS1-S5 stromal cells by ELISA assay. Umbilical cord blood CD34＋ cells were cocultured with hAGMS1-S5 feeder cells , and hematopoietic cells were collected at day 14 for colony analysis in methylcellulose semisolid medium. The results showed that human aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells S1-S5 expressed IL-6, SCF, Flt3-L and OSM mRNA, but did not express IL-3, TPO, M-CSF and LIF mRNA. In the supernatant of hAGMS1-S5 cells, IL-6, SCF and Flt3-L could be detected by ELISA assay at different levels, while there was no significant difference between groups of hAGMS1-S5 (P>0.05). When cocultured with umbilical cord blood CD34＋cells, hAGMS1-S5 could support the expansion of CFU-GM, BFU-E, and CFU-Mix. The supportive effects of hAGM S1-S5 were significantly different (P<0.05), hAGM S3 and S4 were better than hAGM S1, S2, and S5. It is concluded that detection of hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells provided a solid foundation to elucidate the mechanism of hematopoiesis and the hematopoietic supportive effect of these stromal cells.
Key wordsaorta-gonad-mesonephros; stromal cell; hematopoietic growth factor
近年研究表明，主动脉－性腺－中肾（aorta-gonad-mesonephros， AGM）区是哺乳动物胚胎期永久造血（definitive hematopoiesis）的起源部位，该区的造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有向粒系、红系、淋巴系等造血各系分化的能力［1-3］。作为多潜能HSC出现的最早部位，AGM区具有胚胎造血发生发育所需的重要微环境，正成为国际上造血发生、分化机制研究中的热点。本研究首次对体外培养中的人胚胎AGM区基质细胞表达的造血生长因子进行了检测，为探讨AGM区造血微环境在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用研究提供基础资料。
材料和方法
主要试剂
α-MEM、马血清、β-巯基乙醇、Glutamax-I（Gibco公司产品），胎牛血清（Hyclone公司产品），氢化可的松、丝裂霉素C（Sigma公司产品），总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒（Invitrogen公司产品），琼脂糖、DNA分子量标记（Biolabs公司产品），人IL-6、SCF ELISA 试剂盒(晶美生物工程有限公司产品)，人Flt3-L ELISA试剂盒（R&D Systems公司产品）， CD34＋细胞分选试剂盒（德国Miltenyi Biotec公司产品），造血细胞长期培养基MethoCultTM H5100及造血祖细胞集落培养基MethoCultTM GF+ H4435（加拿大Stem Cell 公司产品）。
人AGM区基质细胞的培养
收集经米非司酮及米索前列醇药物流产的30-35天的人胚胎，按本室方法，已建立5株人AGM区基质细胞，分别命名为hAGMS1-S5［4］。分别取第5代的hAGMS1-S5细胞，接种至25 cm2培养瓶，其中培养液含有20％胎牛血清、5％马血清、10 μmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L Glutamax-I及1 μmol/L 氢化可的松的α-MEM。并置于37℃、5％ CO2和饱和湿度培养箱中培养。
造血生长因子mRNA表达的RT-PCR检测
使用TRIZOL试剂，按说明分别提取hAGMS1-S5细胞总RNA。逆转录反应按试剂盒操作说明进行。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列分别为SCF：上游5′- GTCATTGTTGGATAAGCGAGAT -3′，下游5′-ATGGCTGCCCAGTGTAGG-3′，PCR产物长度为457 bp； Flt3-L：上游5′- CTGGAGCCCAACAACCTATCT -3′，下游5′- CCAGCGACAGTCTTGAGCC -3′，PCR产物长度为252 bp； IL-3：上游5′- TTTGCCTTTGCTGGACTT -3′，下游5′- TTCCAGTCACCGTCCTTG -3′，PCR产物长度为222 bp； IL-6：上游5′- GAGGGCTCTTCGGCAAAT -3′，下游5′- CTGGCTCTGAAACAAAGGATAT -3′，PCR产物长度为313 bp； M-CSF：上游5′- TGCGTCCGAACTTTCTATG -3′，下游5′- CACTGCTAGGGATGGCTTT -3′，PCR产物长度为202 bp； TPO：上游5′- ATTGCTCCTCGTGGTCAT -3′，下游5′- CTCCTCCATCTGGGTTTT -3′，PCR产物长度为220 bp； LIF：上游5′-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3′，下游5′- ATTTGGGTTTAGCGATGC-3′，PCR产物长度为399 bp； OSM：上游5′- GCTGGACAACTCAGACACG -3′，下游5′- AACACGGAAAGGAGGAAGT -3′，PCR产物长度为697 bp。 PCR扩增条件： 94℃预变性2分钟，然后94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后观察结果。
造血生长因子水平的ELISA检测
分别取第5代的hAGMS1-S5细胞接种于24孔板，每样本复种3孔，每孔培养体系1 ml。培养至细胞融合达70％-80％时换液，继续培养48小时，收集培养液，离心后取上清，分装，贮于-20℃备用。按ELISA试剂盒操作说明测定hAGMS1-S5细胞培养上清中IL-6、SCF和Flt3-L水平。
脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养后的集落形成能力分析
分别取第5代的hAGMS1-S5细胞，接种至24孔板，细胞融合达80％-90％时予丝裂霉素C（浓度10 μg/ml）处理2小时，经PBS洗3次后加基质细胞培养液，置于37℃、5％ CO2和饱和湿度培养箱中备用。采集本院产房出生的正常足月新生儿的脐血，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离得到脐血单个核细胞后，按照CD34+细胞分选试剂盒说明，采用免疫磁珠法进行CD34+细胞的分离纯化。将纯化的脐血CD34+细胞按2.0×104/孔接种于已制备好hAGMS1-S5饲养层的24孔板中进行共培养，根据培养体系中饲养层的种类不同分为6组：无饲养层组（对照组）、hAGMS1-S5饲养层组，培养液均为含1 μmol/L 氢化考的松（hydrocortisone）的H5100（其成分为α-MEM含125％胎牛血清、125％马血清、10 μmol/L 2-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷胺酰氨、0.2 mmol/L i-肌醇、16 μmol/L叶酸），置于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3-4天半量换液1次。培养14天时收获造血细胞（收获细胞具体方法见参考文献［5］）制成单个核细胞悬液，用甲基纤维素半固体集落培养法测定其集落形成能力，培养液为H4435 (其成分为IMDM中含1.0％甲基纤维素，30％胎牛血清，1％ BSA, 10-4mol/L 2-巯基乙醇，2 mmol/L L-谷胺酰氨，50 ng/ml rhSCF, 20 ng/ml rhGM-CSF, 20 ng/ml rhIL-3, 20 ng/ml rhIL-6, 20 ng/ml rhG-CSF, 3 U/ml rhEPO)，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养，14天时计数粒单系集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）和混合集落形成单位（CFU-Mix）。
统计学处理
计量资料以均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS 10.0软件包中单因素方差分析组间差异。
结果
人AGM区基质细胞的体外培养
第5代的hAGMS1-S5细胞在体外均生长迅速，呈贴壁生长。经4-5天细胞长满，其形态学表现主要为成纤维间质细胞样，少量呈内皮样，是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群（图1）。
非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究
回输的血小板在体内清除机制研究进展