尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制影响的研究(1)-找论文网

【摘要】 为了研究尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，采用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA凋亡带，用细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因bcl2、bax的蛋白表达。结果表明，实验组自培养8小时起琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA梯形凋亡带。Bcl2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl2/Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异（P<0.05）。结论：尼莫地平及阿糖胞苷均能促进HL60细胞凋亡，诱导其凋亡的机制与下调bcl2及上调bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平能加强阿糖胞苷促进HL60细胞凋亡，其机制与协同下调bcl2的表达有关。

【关键词】 尼莫地平阿糖胞苷凋亡 HL60细胞系蛋白表达 Bcl2 Bax

Effect of Nimodipine on Mechanisms of HL60 Cell Apoptosis Induced by Cytarabine

Abstract The aim was to study the mechanisms of HL60 cell apoptosis induced by nimodipine (NMDP ) and cytarabine (AraC). The DNA fragment was detected by agarose gel electrophoresis. The expressions of bcl2 and bax gene proteins related with apoptosis were investigated by immunohistochemistry. The results showed that HL60 cell apoptosis rate had been increasing in the experimental groups compared with the control group since culturing 8 hours. The expression of Bcl2 protein was lower and the expression of Bax protein was higher in the experimental groups than that in the control group, while ratio of bcl2/bax was lower in the experimental groups than that in the control group. It is concluded that NMDP and AraC induce apoptosis of HL60 cells, and the mechanism of apoptosis induced by them may downregulate the expression of bcl2 gene and upregulate the expression of bax gene. The mechanism of HL60 cell apoptosis induced by AraC and NMDP is probably associated with the downregulation of Bcl2 protein expression.

Key word nimodipine; cytarabine; apoptosis; HL60 cell line; protein expression; Bcl2; Bax

白血病多药耐药性(MDR)的产生是导致化疗失败的一个主要原因［1],凋亡相关基因bcl2、bax的表达与白血病耐药之间有着密切关系［2]。bcl2表达增高能使白血病细胞抵抗糖皮质激素、VP16、DNR、MIT、AraC、VCR、ADM和ATRA等化疗药物及X射线所诱导的凋亡， bax是调节bcl2肿瘤耐药的重要基因之一［3］。研究表明，钙通道拮抗剂尼莫地平(nimodipine, NMDP) 通过加强化疗药物诱导细胞凋亡而达到化疗增强作用［4、5］。NMDP是如何加强化疗药物诱导细胞凋亡的？其作用机制尚不明了。为此，本研究以人类早幼粒细胞白血病细胞株（HL60）为研究对象，探讨尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，为临床合理用药提供理论依据。

材料和方法

细胞和主要试剂

HL60细胞株引自武汉大学典型培养物保藏中心。NMDP购来自德国拜尔公司，AraC购自上海华联制药厂。Rabbit AntiBcl2、Rabbit AntiBax、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉Boster公司。基因组DNA抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司，DNA 电泳marker购自TaKaRa公司。

细胞培养和分组

HL60细胞在含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中悬浮培养。每2-3天传代1次。实验前调整细胞浓度为5×105/ml。实验时将对数期生长细胞分为4组。A组：对照组（HL60组）； B组：HL60+ NMDP（0.01 mg/ml）组； C组：HL60+ Arac(0.05 mg/ml)组； D组：HL60+NMDP+Arac组。细胞分别培养0、8、16、24小时。

DNA琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带。取不同培养时间的HL60细胞各1.5×106个，按照DNA抽提试剂盒的说明提取DNA，用冷乙醇洗涤2次，最后在 2.5%的琼脂糖凝胶块上于4 V/cm条件下，电泳1小时，紫外灯下观察DNA电泳条带。

凋亡调节基因检测

Bcl2蛋白表达取不同培养时间的HL60细胞各1×106个，离心，涂片，干燥，丙酮固定30分钟。浸泡于1份30% H2O2和50份甲醇的混合液中30分钟，然后加入pH 7.8的0.1%胰酶液中37℃消化10分钟，用PBS洗3次后按照试剂盒说明逐步进行操作，其中阴性对照组不加一抗，改加PBS。最后在DAB试剂显色后，脱水、透明、封片、照相。图象扫描测定积分光密度值。

Bax蛋白表达实验方法与Bcl2蛋白表达的测定相似。

统计学处理

所有数据均用±SD表示，采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。

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