作者：汪涯雅，张东华，刘文励，周红升，张路，戴敏，黄振倩， 谭获 熊平
【摘要】 本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。
【关键词】 树突状细胞； HA-1基因; 树突状细胞核酸疫苗; 造血干细胞移植; 细胞毒性T淋巴细胞
Construction of HA-1-DC Nucleic-acid Vaccine and Induction of Specific Cytotoxic T Lymphocytes
AbstractThe purpose of this study was to construct a HA-1-DC nucleic acid vaccine and to induce anti-leukemia effect after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT). The dendritic cells (DCs) were generated from HSCT donors in vitro, and its immunologic activity was studied by using flow cytometry and mix lymphocyte reaction. HA-1 gene was electroporated into the cultured DCs to construct a DC nucleic acid vaccine. After transfecting for 48 hours, the expression of HA-1 protein was detected by Western blot. The DCs were cultured with isogenic lymphocytes to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). The cytotoxicity of the CTLs was detected by LDH assay. The results showed that the DCs derived from peripheral blood monocytes (PBMCs) expressed the DC phenotype, and were effective in stimulating proliferation of the allogenic lymphocytes. After electroporating for 48 hours, HA-1 protein was detected by Western blot. The cytotoxity of inducing CTLs was higher than that in the control group. It is concluded that the minor histocompatibility antigen HA-1 can be considered as a target of immunotherapy against leukemia after HSCT.
Key wordsdendritic cell； HA-1 gene； DC nucleic acid vaccine； hematopoietic stem cell transplantation； cytotoxic T lymphocyte
树突状细胞（dendritic cell, DC）是目前体内功能最强的专职抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC），它们能高效摄取、处理抗原，并将多肽呈递给静息型T细胞，诱导特异性免疫应答，因而成为肿瘤免疫治疗中重要的运载工具。通过转基因技术，将编码肿瘤表面的抗原基因导入DC构建相应的核酸疫苗，是近来肿瘤免疫治疗的热点［1，2］。异基因造血干细胞移植（allogeneic hemato- poietic stem cell transplantation, allo-HSCT） 是治疗白血病最有效的方法， 但移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)和复发严重影响了病人的存活率。如何增强移植物抗白血病（graft versus leukemia, GVL）效应，减少复发同时又不诱发GVHD，是移植成功的关键。限制性表达于造血干细胞和白血病细胞表面的次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigens, mHags）在分离GVL和GVHD中起重要的作用［3］。 因此， 本实验应用HA-1基因构建真核表达载体，转染DC，诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs），发挥抗白血病效应。
材料和方法
材料
人重组IL-4和GM-CSF均购自Peprotech公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，RPMI 1640、丝裂霉素C、MTT均为Sigma公司产品，胎牛血清（FCS）购自杭州四季清公司。PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD80和CD14、FITC标记的鼠抗人单克隆抗体CD83和CD86及同型对照均购自eBioscience公司。XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶、1 kb DNA Marker购自MBI公司。胶回收、质粒小提、大提试剂盒均购自上海华舜公司。T4DNA连接酶为Promega公司产品。抗his单克隆抗体购自Novagen公司。人IL-2购自北京四环生物制品厂。pcDNA3.1/hisA和pEGFP-C1 由我院妇科肿瘤中心陈刚博士惠赠，pcDNA3.1-HA-1由荷兰勒登(Leiden)大学医学中心Dr.Prof.E.A.J.M.Goulmy惠赠。流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品），电转仪（ECM2001 BTX公司产品），电转杯（8mmgap,GTS公司产品），酶标仪（Biotech公司产品）。
方法
DC体外培养取HA-1阴性表达的移植供者外周血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，PBS液洗涤3次，用RPMI 1640培养液悬浮细胞，按5×106/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，置37℃、5％ CO2培养箱中培养2小时，轻轻吹打去除悬浮细胞，即获得贴壁的外周血单核细胞（PBMC），每孔加入2 ml含10％FCS的RPMI 1640培养液，加入细胞因子rhGM-CSF 100 ng/ml及rhIL-4 40 ng/ml。隔天半量换液，补充细胞因子。于培养第7天收集悬浮细胞。
流式细胞术分析表型DC悬液用PBS液洗涤2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加入Eppendorf管，每管100 μl，再分别加入PE标记的CD80、CD14及FITC标记的CD83、CD86，4℃避光孵育30分钟，PBS液洗涤，1％多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。
同种混合淋巴细胞反应分离健康人外周血获得单个核细胞，在培养箱中培养2小时，收集悬浮细胞即同种异体淋巴细胞作为反应细胞，刺激细胞（DC及同基因的PBMC）用完全培养液调整浓度为1×106/ml，加入终浓度25 μg/ml的丝裂霉素C，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤3次，用含8％FCS的RPMI 1640培养液悬浮调整浓度，分别以1×103/孔、5×103/孔和1×104/孔加入96孔板中，每组设3个复孔，每孔再加入1×105反应细胞，终体积为200 μl，以未加刺激细胞的淋巴细胞为阴性对照。37℃、5％ CO2 培养72小时，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光37℃温箱中孵育4小时，离心去上清，每孔加入200 μl DMSO,取波长570 nm检测A570值。结果用3孔均值表示。
刺激指数（SI）=加刺激细胞孔的A570值/阴性对照孔的A570值。
重组人HA-1质粒的构建用XbaI和BamHI限制性内切酶从
pcDNA3.1-HA-1中切下358 bp HA-1的cDNA，其中包括T细胞决定簇VLHDDLLEA，经T4DNA连接酶插入pcDNA3.1/hisA的多克隆位点中，经过酶切和测序确定重组是否准确，命名为pcDNA3.1/hisA-HA-1。
转染DC收集培养7天的DC，用RPMI 1640培养液洗涤，电转缓冲液（按Eppendorf公司提供的缓冲液配方配置，保证细胞在其中孵育30分钟，存活率在90％以上）重悬细胞，调整浓度为1×106/ml，加入重组质粒，终浓度为20 μg/ml。电转条件为：常温，电压450 V，80微秒，脉冲1次。在30分钟内完成，加入完全培养液，置于温箱内继续培养24-72小时。同时用pEGFP-C1转染作对照，评价DC的转染效率。
蛋白表达的Western blot检测于转染48小时后收集细胞，用一步裂解法提取总蛋白，经98℃变性5分钟后，垂直电泳。再用电转仪将凝胶中的蛋白转移到醋酸纤维膜上，5％脱脂奶封闭，加His单克隆抗体（1∶1 000），4℃过夜，TBS-T液洗3次，再加入HRP标记的二抗（1∶200），37℃恒温摇床摇动2小时，TBS-T洗涤3次，于暗室中用化学发光法显色。
尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制影响的研究
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