【摘要】 本研究探讨D-柠檬烯对K562白血病细胞增殖的影响及机制。应用MTT试验观察不同浓度D-柠檬烯作用后K562细胞增殖的改变；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果表明： 在0.125-1.0 mmol/L浓度范围内，D-柠檬烯对K562细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系。 典型的细胞形态学改变、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带及流式细胞仪检测出亚G1峰共同证实了D-柠檬烯能诱导K562白血病细胞凋亡。结论： D-柠檬烯抑制K562细胞的增殖并呈剂量依赖的方式，使细胞滞留于G1期，诱导其凋亡。
【关键词】 D-柠檬烯； K562细胞； 细胞凋亡； 细胞增殖
Proliferation Inhibition and Apoptosis Induction of K562 Cells by D-limonene
AbstractThis study was aimed to investigate the effect of D-limonene on K562 leukemia cells and its mechanism. Inhibitory effect of D-limonene on proliferation of K562 leukemia cells was assayed by MTT method and cell apoptosis was detected by flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis, the morphologic change of K562 cells was observed by microscopy. The results showed that when K562 cells were treated with 0.125-1.0 mmol/L of D-limonene for 48 hours, the proliferation of K562 cells was obviously inhibited in dose-dependent manner. Typical morphological changes and the typical DNA ladder on agarose gel electrophoresis for analysis of cellular apoptosis were significantly appeared in D-limonene treated K562 cells. Simultaneously, the sub-G1 peak was found in FCM analysis. It is concluded that the D-limonene can inhibit proliferation of K562 cells in dose-dependent manner, cause cell detained at G1 phase and induce apoptosis of K562 cells.
Key wordsD-limonene; K562 cell; cell apoptosis; cell proliferation
D-柠檬烯（D-limonene）是一种单萜烯类化合物，广泛存在于芸香科柠檬、柑桔精油及其他植物中，具有抗氧化、抗炎、利胆溶石等作用。近年来，人们发现D-柠檬烯具有抗癌活性，用于预防及治疗化学致癌物诱导的结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌等［1-6］ ，取得了一定的效果。目前对其抗癌作用的研究主要集中在实体瘤方面，对非实体瘤作用的研究报道尚少。我们以K562白血病细胞作为靶细胞，探讨D-柠檬烯对其抑制增殖、诱导凋亡的作用。
材料和方法
主要试剂
RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）；小牛血清（杭州四季青公司产品）；淋巴细胞分离液（密度1.077，上海试剂二厂生产）；溴化噻唑蓝四唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT）和D-柠檬烯（Sigma公司产品）。
细胞系和细胞培养
K562细胞株由大连医科大学组胚教研室提供，K562细胞悬浮于含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞调成适当浓度进行实验，台盼蓝拒染率＞95%。
细胞增殖抑制的MTT测定
2×104/ml K562细胞悬液接种于96孔培养板，每孔
0.2 ml。实验组：加不同浓度D-柠檬烯；对照组：加与D-柠檬烯等体积培养液；空白组只有培养液，无细胞。每组设6个复孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养48小时后，每孔加入新配置的MTT（5 mg/ml）10 μl，混匀，继续孵育4小时，离心，弃培养上清，加入200 μl二甲亚砜，震荡5分钟，酶标仪测570 nm处OD值。按下述公式计算抑制率。
抑制率=［（A对照-A实验）/（A对照-A空白 ）］×100%
形态学观察
取培养后2、4、6天的细胞洗涤2次后，涂片，自然干燥，Wright-Giemsa染色，1 000倍油镜下观察细胞形态有无凋亡特征变化。
流式细胞术检测
收集D-柠檬烯作用48小时后的细胞，用PBS液洗涤2次，缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇1 ml固定1小时。再用PBS液洗2次，将等体积的细胞悬液和用含RNA酶的碘化丙锭（PI）5 μg/ml、 4℃染色30分钟，以激发波长488 nm测定，并用ModfitLT 2.0软件分析细胞周期分布。低于G0/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
收集D-柠檬烯作用后2×106个细胞，经PBS洗涤，提取DNA，样品溶于少量TE中，UV160紫外分光光度计测定260 nm光吸收值，DNA上样量为4 μg/lane，经1.5%琼脂糖凝胶 (含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳，70 V，2小时，紫外灯下检测并摄片。
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