用Midi MACS方法从白血病患者分选CD34＋/CD123＋细胞(1)

                       作者：王光平，曹星玉，信红亚，李群，齐振华, 陈方平

【摘要】  本研究的目的是应用Midi MACS方法从急性髓系白血病（AML）患者骨髓细胞分选CD34+/CD123+细胞。首先，用淋巴细胞分离液从AML患者骨髓细胞分离单个核细胞（BMMNC），然后再通过Midi MACS方法相继分选出CD34＋细胞，以及从CD34+细胞中分选出CD123＋细胞并通过流式细胞术分析分选后细胞的富集度和回收率。结果显示：经过第一次分选后，CD34+细胞的富集度高达98.73%，平均为95.6%，其回收率最高可达到84.6%，平均为51%；第二次分选后，CD34+/CD123+细胞的富集度高达99.23%，平均约为83%；相对于分选前BMMNC而言，CD34+/CD123+细胞的回收率为34%，但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言，其回收率为56%。结论： Midi MACS方法可用于AML患者骨髓CD34+/CD123+ 细胞的分选，分选后细胞的富集度和回收率与文献报道的通过FACS方法所获得的结果相类似。

【关键词】  CD34+/CD123+ 细胞； 分选方法； Midi MACS； 白血病

　　CD34+/CD123+  Cell Sorting from the Patients with Leukemia    by Midi MACS Method

　　AbstractThe aim of this study was to sort the CD34+/CD123+ cells from the bone marrow cells of patients with acute myeloid leukemia (AML) by Midi MACS method. Firstly, the bone marrow mononuclear cells (BMMNC) were isolated from the patients with AML with Ficoll Paque, CD34+ cells were then isolated by Midi MACS method followed by the isolation of CD34+/CD123+ cells from the fraction of CD34+ cells. The enrichment and recovery of CD34+ and CD34+/CD123+ cells were assayed by FACS technique. The results showed that the enrichment of CD34+ cells was up to 98.73%, its average enrichment was 95.6%, and the recovery of CD34+ was 84.6%， its average recovery was 51% after the first round sorting, by the second round sorting, the enrichment of CD34+/CD123+ cells was up to 99.23%, its average enrichment was 83%. With regard to BMMNCs before sorting, the recovery of CD34+/CD123+ was 34%. But, on the CD34+ cells obtained by the first round sorting，its recovery was 56%. In conclusion, these results confirmed  that the method of Midi MACS sorting can be applied to sort CD34+/CD123+ cells from  the bone marrow cells of AML patients, which give rise to the similar enrichment and recovery of the sorted cells with that of literature reported by the method of FACS.

　　Key wordsCD34+/CD123+ cell； sorting  method；  Midi MACS; leukemia

　　白血病，尤其是急性髓系白血病（AML），是起源于少量的干/祖细胞疾病。这些干/祖细胞是一些发生了突变的造血干/祖细胞，即白血病干/祖细胞（LSPC）［1，2］。除了具有正常造血干细胞（HSC）的自我更新和某些细胞表型如CD34+、CD38-、CD71-以及HLA-DR-等特征外，LSPC还具有自己特有的表型，即CD90-、CD117-、CD123+［3-5］。因此，依据这些特异性的表型，可对LSPC进行分离和纯化。在分离正常造血干/祖细胞（HSPC）中，MACS分选方法得到了广泛的应用。但是，采用该方法分选LSPC的报道却很少。为此，本研究应用Midi MACS分选方法对AML患者的CD34+/CD123+双阳性细胞进行了分选。

　　材料和方法

　　单个核细胞的分离

　　无菌抽取AML患者（2例M2a，1例M1）3-6 ml骨髓，放于加有肝素的15 ml试管内，用等体积无钙离子的PBS缓冲液（Gibco产品）洗涤和稀释后，慢慢加到含有淋巴细胞分离液（购于北京鼎国公司）的试管内，于室温350×g离心20分钟。离心后，小心除去上清液并吸取白细胞层于另一新试管内，首先用5 ml 无钙离子PBS+2 mmol/L EDTA缓冲液（以下简称为缓冲液1）洗涤细胞，于130×g离心5分钟。然后，用5 ml缓冲液1重悬细胞并于90×g离心2次，每次5分钟。离心后，再用2 ml的缓冲液1重悬细胞并计数细胞。经60×g离心5分钟后，按每108个细胞用300 μl的比例加入无钙离子的PBS+2 mmol/L EDTA+0.5%  FCS缓冲液（以下简称为缓冲液2）重悬细胞。

　　CD34+细胞的分选

　　首先用CD34多分选试剂盒（Miltenyi Biotec公司产品）分选CD34+细胞，亦即取已混匀好的封闭试剂100 μl加入到300 μl的上述细胞悬液中,混匀后置室温5分钟。然后，每108个细胞加入100 μl的CD34磁珠（小于108个细胞，仍加入100 μl的CD34磁珠），轻轻混匀后，于4℃作用30分钟。用5 ml缓冲液2重悬细胞，于90×g离心2×5分钟后，再用5 ml缓冲液2重悬细胞。将Midi分选柱子（Miltenyi Biotec公司产品）安装在分选器上，过柱分选之前，先用3 ml缓冲液2过柱以润湿柱子。然后，将上述已标记好的细胞悬液加到柱子上并经4×5 ml缓冲液2过柱洗涤。洗涤后，将分选柱子从分选器上撤离下来并置于另一新的15 ml试管上，用5 ml缓冲液2通过加压的方式洗脱阳性细胞，离心、计数细胞后留取适当数量的细胞用于流式细胞术分析。

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