CD34+/CD123+ 双阳性细胞的分选
为分选CD34+/CD123+ 细胞，首先需除去细胞上已结合的磁珠。其方法是，每毫升上述细胞悬液加入20 μl的磁珠除去试剂，于4℃作用30分钟。待反应结束后，再用3×3 ml缓冲液2，按上述方法过柱洗涤。不同的是，此时应收集通过柱子的细胞。将细胞悬液离心后，每107个细胞用50 μl缓冲液2重悬细胞（小于107个细胞仍用50 μl的缓冲液）以及每107个细胞加入30 μl的终止液。然后，在上述细胞悬液中加入80 μl的缓冲液2，混匀后再加入20 μl的抗-CD123-PE抗体（Miltenyi Biotec公司产品）于上述细胞悬液中并混匀，于4℃作用30分钟。 用2×2 ml的缓冲液2洗涤细胞， 200×g离心10分钟，并按每107个细胞加入80 μl的比例加入缓冲液2，重悬细胞后再每107个细胞加入20 μl的抗PE-磁珠（Miltenyi Biotec公司产品），于4℃作用30分钟。用缓冲液2洗涤细胞2次， 90×g离心5分钟。最后，每108个细胞用500 μl缓冲液2重悬细胞，用于再次分选，过柱分选方法同前。 过柱后，计数细胞并留取适当数量的细胞用于流式细胞术分析。
流式细胞术分析
分别取2×105个分选前后的细胞放于一试管内，用PBS缓冲液洗涤2次。经350×g离心10分钟后，除去上清液并将细胞重悬于500 μl的PBS缓冲液中。混匀后，取250 μl的细胞悬液于另一试管内，并将各管分别标记为阴性和阳性。在阳性管内加入15 μl的CD34-FITC抗体（PharMingen公司产品），而在阴性管内分别加入15 μl的鼠IgG1-FITC和（或）鼠IgG1-PE即在CD34-N试管内加入鼠 IgG1-FITC抗体，而在CD34-N/CD123-N试管内加入鼠 IgG1-FITC和鼠IgG1-PE抗体标记细胞作为阴性对照。室温避光作用30分钟后，加入1 ml的PBS缓冲液，于350×g离心10分钟，除去上清液并加入约500 μl的PBS缓冲液重悬细胞，上机分析。由于在CD34+/CD123+ 双阳性细胞分选的过程中，细胞已用抗-CD123-PE抗体进行了标记，因此在进行流式细胞术分析时不需再另外加入抗-CD123-PE抗体。
结果
用抗CD34磁珠第一次分选CD34+细胞后，CD34+细胞的富集度高达98.73%（附图1-4），平均为95.6%，回收率最高可达到84.6%，平均为51%。第二次分选后，CD34+/CD123+细胞的富集度可高达99.23%（附图5-8），平均约为83%。 相对于分选前单个核细胞而言，CD34+/CD123+细胞的回收率为34%，但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言，其回收率为56%，与第一次分离的CD34+细胞的回收率相似。
讨论
根据细胞表面分化抗原表达的差异，当前常常采用两种方法来分选目的细胞，即应用流式细胞仪的FACS和通过吸附单克隆抗体-磁珠系统的MACS分选方法。FACS方法分离后得到的细胞的纯度很高，但该方法需要昂贵的流式细胞仪并且操作复杂。相反，MACS系统分选法所需仪器简单，操作容易。同时，通过MACS系统分离的细胞也可以获得很高的纯度和回收率，如本研究所分离的CD34+和CD34+/CD123+细胞的富集度分别可达98%和99%，不低于通过FACS分选所得的LSC细胞［6］。另外，MACS分选系统使用的磁珠极小，其直径仅为30-60 nm，约为一个淋巴细胞的千分之一，并不影响分选后目的细胞的功能，分选后的细胞仍可用于后续的细胞培养和功能研究。由于在AML患者CD34+部分细胞内表达CD123的细胞在99%以上，而在正常人CD34+部分细胞内表达CD123的细胞非常低。同时，将AML患者的CD34+/CD123+细胞移植给NOD/SCID小鼠可形成白血病。因此，CD123被认为是人类AML干细胞特有的标志［5］。另外，正常骨髓CD34+细胞的含量很低，仅为骨髓有核细胞的1%，而本研究所选择的AML病例其CD34+细胞和该部分细胞内表达CD123的细胞也很高（如附图中的2和6），因此本研究从AML患者骨髓分选到高富集度的CD34+/CD123+细胞，其绝大多数细胞应是LSPC。本研究应用MACS分选系统成功分选到高富集度的CD34+/CD123+细胞，这也为利用该方法分选其它实体瘤起始细胞提供了实验基础。为获得高纯度和高回收率的CD34+/CD123+细胞特别是高比例的CD34+/CD123+的LSPC以保证后续其它实验有足够数量高纯度的细胞，应选择外周血白细胞数、白血病幼稚细胞特别是CD34+/CD123+细胞含量较高的病例。为此，本研究通常是在分选前测定患者骨髓CD34+/CD123+细胞的含量之后，再进行分选。另外，由于白血病患者血液样本的特殊性，在分离单个核细胞时，最好用无钙离子的PBS缓冲液多次洗涤样本，并且在分离之前对样本进行稀释。另外，用加有2 mmol/L EDTA和05% FCS的PBS缓冲液也可以防止细胞聚集成团块、黏附于试管以及减少过柱时的损失。
【参考文献】
1 Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, et al. A cell initiating human acute myeloid leukemia after transplantation into SCID mice. Nature, 1994; 367(6464):645-648
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4 Blair A, Sutherland HJ. Primitive acute myeloid leukemia cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo lack surface expression of c-kit(CD117). Exp Hematol, 2000; 28:660-671
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6 Guzman ML, Neering SJ, Upchurch D, et al. Nuclear factor-kappaB is constitutively activated in primitive human acute myelogenous leukemia cells. Blood, 2001; 98:2031-2307.
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