作者：孙国栋， 段现民， 张彦平， 尹志柱，
牛小利， 李艳凤1，赵有良，牛海江
【摘要】 为了探讨中国汉族人群弱D15 型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景，采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体Rh D、C、c、E、e抗原表型；采用序列特异性引物-聚合酶链反应（SSP-PCR）方法同时检测RHD基因和RHCE基因；标本测序分析RHD基因全长编码区序列；同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果表明， 血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中，有18例为弱D15 型（占D抗原弱阳性表型56%），RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变：845G>A，编码区序列其它部分与正常RHD序列相同；检测Rh小因子有3种表型CcEe（2例）、CcEe（ 2例）、ccEe（14例）,分别占弱D15 型的11%、11%、78%，血清学检测结果与分子生物学检测结果一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+，提示基因型为DCe/DcE；其余为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce和DcE/dce。结论： 弱D15型是中国人群中最主要的弱D型，其中大部分为杂合型。
【关键词】 弱D型；弱D15； RHD基因； RHCE基因； 基因突变； 序列分析
Molecular Background of Weak D Type 15 as the Predominant Weak D Type Found in Chinese Population
AbstractThis study was aimed to investigate the molecular genetic basis and serological phenotype of Rh weak D type 15 individuals. Samples were identified by serological tests and genotyped by sequence specific primer-PCR（SSP-PCR）, and were sequenced to detect the changes of all ten RHD exons. The number of gene RHD was detected through SSP-PCR. The results showed that in tested individuals of weak D type confirmed by the IAT, 18 cases（56% in weak D）were weak D type 15. Rh factors found in 2 weak D type 15 individuals (11%) were C﹢c﹢E﹢e; Rh factors found in 2 weak D type 15 individuals (11%) were C﹢c﹢E-e﹢; others(78%) were c-c﹢E﹢e﹢. The results by serological tests were consistent with the results genotyped by PCR-SSP method. In all 18 samples, the sequencing result revealed a gene mutation 845G>A at the exon 6 of the RHD and the point mutation changed amino acid G282D of the RhD polypeptide. The zygosity test demonstrated that 2 out of 18 weak D type 15 individuals were RHD+/RHD+ homozygous (two DCe/DcE), 16 cases were RHD+/RHD- heterozygous (two DCe/dce and fourteen DcE/dce). It is concluded that Weak D type 15 is predominant in weak D individuals of Chinese Han Nationality, and most of them are heterozygous with various RH haplotypes.
Key wordsweak D type； weak D type 15; RHD； RHCE； gene mutation； sequencing analysis
Rh血型系统是被国际输血协会（ISBT）确认的29个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统，Rh血型系统抗原特别是D抗原(ISBT004.001;RH1)是临床上导致新生儿溶血病、溶血性输血反应的最重要的血型抗原［1］，具有很强的免疫原性。人类Rh血型基因位于染色体1p34.3-36.1,包括D基因、CE基因和SMP1基因［2］，RHD和RHCE分别由10个外显子组成，编码区总长均为1 251 bp,分别编码417个氨基酸组成的糖蛋白： D抗原和CcEe抗原。SMP1基因与RHD方向相同，含有7个外显子。在RHD基因两端各有一段Rhesus盒序列［3］，RHD基因阴性单倍体是由于上下游Rhesus盒之间RHD基因完全缺失，形成一个融合的Rhesus盒（hybrid Rhesus box）。由于Rh血型复杂而丰富的遗传多态性,因此不同种族间RHD分子遗传背景存在许多差异，而且还存在多种D变异体。弱D是D抗原的一种变异体，一般是由于RHD基因编码区发生碱基突变，进而使得编码的RhD蛋白氨基酸发生替换，这种氨基酸替换主要位于胞内和跨膜区域，表现为抗原位点数减少，但抗原表位数目基本不变［4］。通常采用间接抗球蛋白试验(indirect antiglobulin test, IAT)来对RhD抗原进行确认，D抗原阴性个体在中国汉族人群中的比例约为0.3%-04%［5］.大部分RhD阳性个体在盐水介质中反应为阳性，但有一小部分个体在盐水介质中反应为阴性，IAT检测为阳性，这些即为D抗原弱表现型。我们在长期的RhD阴性筛选定型工作中，应用血型血清学及分子生物学PCR-SSP、DNA序列分析等检测在214000名无偿献血者中观察到32例D抗原弱阳性个体；其中18例弱D15型，占D抗原弱阳性表型的56%(包括部分D)，且弱D基因存在于不同的单倍体上，现将结果报告如下。
材料和方法
研究对象
汉族，均为邯郸市无血缘关系的志愿无偿献血者。在常规进行RhD阴性筛选定型工作中盐水法初筛为D阴性，IAT检测为D抗原弱表现型，为了进一步了解其分子遗传学背景对其进行分析鉴定。
血型血清学分型
采用DBL生产的单克隆IgG抗-D（clone：415 1E4）和单克隆IgM抗-D（clone：175-2）混合试剂进行常规的盐水法初筛；盐水介质反应为阴性者再经抗球蛋白试验予以确认； IAT的确认采用中国医学科学院输血研究所、上海血液中心提供的人源血清和DIAGAST生产的由IgM（clone：P3×61）、IgM（clone：P3×21223B10）、IgG（clone：P3×290）、IgG（clone：P3×35）混合组成的单克隆抗-D（RH1），以及DBL生产的单克隆IgG抗-D（clone：415 1E4）和单克隆IgM抗-D（clone：175-2）混合试剂。使用IMMUCOR生产的单克隆IgM抗-C（MS24）、抗-c（MS33）、抗-E（MS80）、抗-e（MS16）进行RhC、c、E、e表型鉴定。
基因组DNA制备
应用美国G＆T公司DNA抽提试剂盒进行。采用盐析法取0.3 ml EDTA抗凝外周血,加入1 ml红细胞裂解液，离心弃上清，加入170 μl核裂解液及4 μl SDS，剧烈震荡后，再加入72 μl NaCl溶解液，离心后，取上清加入210 μl异丙醇沉淀DNA,将DNA溶于TE溶液中，保存待用。
RHD的SSP-PCR基因分型
参照文献［6］RHD基因定型方法进行。用6对序列特异性引物扩增RHD基因，同时扩增人类血小板抗原（HPA-1）作为内对照。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴乙啶）上点样，同时采用宝生物工程公司的 DNA Marker DL 2000作为标记，其片段长度为：100、250、500、750、1 000、2 000 bp。10 V/cm电泳20分钟。然后在紫外光下观察结果，拍照记录。
RHCE的PCR-SSP基因分型
采用美国G＆T公司的试剂盒测定标本的RHCE基因。内对照引物为人类生长激素（HGH）基因特异性引物，扩增产物为429 bp。PCR产物观察同RHD的SSP-PCR基因分型 。
RHD基因数目检测
参照文献［7］RHD合子型测定方法,观察该个体是否存在RHD基因缺失，进而分析RHD基因数目。1对引物特异性针对融合Rhesus盒,产物为2 778 bp；另1对引物特异性扩增RHD基因第一外显子，产物为767 bp。以人类血小板抗原（HPA）为内对照引物。为提高这两对特异性引物在本实验室的扩增效率，经反复试验将文献［7］ 的扩增条件修改为：95℃予变性10分钟，然后依次按以下程序进行40个循环：94℃30秒，65℃60秒，68℃5分钟。40个循环后，72℃延长5分钟，然后降温至4℃保存。PCR产物在1.6%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴乙啶）上点样，PCR产物观察同RHD的SSP-PCR基因分型 。
RHD基因外显子直接测序
参照文献［8］RHD基因编码区全长序列分析方法，采用10对内含子引物分别特异性扩增标本的RHD基因10个外显子，PCR产物经TaKaRa DNA Fragment Purification kit（大连宝生物公司）纯化，配成25-30 μl的DNA测序模板，分别以各外显子的特异性测序引物直接测序（ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer），测序结果用相应软件进行分析比较。
血小板和组织因子
肿瘤坏死因子α和雷公藤内酯醇调节Raji细胞内VEGF的表达