中国人群中发现的主要弱D型——弱D15 个体的分子背景研究(2)

　　结果

　　血型血清学检测

　　18例标本常规的盐水法初筛D抗原检测为阴性，再经IAT确认为阳性。血清学证实为弱D型，经盐水法Rh其它因子检测，其中2例为CcEe、2例为Ccee、14例为ccEe，分别占弱D15 型的11%、11%、78%。

　　PCR-SSP基因分型

　　PCR-SSP方法检测RHD基因，结果均显示为RhD阳性（图1A）；PCR-SSP方法检测RHCE基因，结果与血清学检测一致（图1D）。

　　RHD基因全长编码区直接测序

　　用10对内含子引物分别扩增18例标本RHD基因10个外显子，结果见图1C。 RHD基因全长编码区序列分析结果显示18例标本的RHD基因在第6外显子均存在碱基突变845G>A，编码区序列其它部分与正常RHD序列相同，而正常D阳性对照标本不存在这一变异（图2）。

　　RHD基因数目分析

　　RHD杂合性试验鉴定显示,18例标本中仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+，提示基因型为DCe/DcE；其余16例标本为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce（2例）和DcE/dce（14例）（图1B）。

　　讨论

　　D抗原位于RHD基因编码的RhD多肽上，该多肽带有6个细胞外环，贯穿红细胞膜12次，氨基端和羧基端均位于胞浆内。RhD多肽分为3个区域：细胞外区、跨膜区、细胞内区［1］。RhD抗原存在许多变异体，如：部分D、弱D、D放散型、D-型、D‥型等，弱D是其中的一种。正常D抗原阳性个体的红细胞表面约有10 000-30 000个抗原分子，弱D表型个体抗原分子数显著减少，且抗原密度与弱D的型别特异性相关［9］，通常为几百至几千个D抗原分子不等，如弱D4.1约为4 000个，弱D17则低于100个分子。在已发表的关于弱D样本的阐述中［4、10］，弱D的形成一般是由于RHD基因编码区发生碱基突变，进而使得编码的RhD蛋白氨基酸发生替换，且多数弱D型的氨基酸替换位于胞内或跨膜区。不同弱D型别的点突变引致的氨基酸替换在RhD蛋白上分布是不均匀的，一般主要分布在氨基酸267-397位，一小部分则分布在氨基酸位置2-13，149，179-225等。本研究的18例标本均为第6外显子845G>A的点突变，氨基酸替换G282D发生在第9跨膜区，跨膜区的突变干扰了膜的整合，进而影响了Rh蛋白在红细胞膜跨膜区的表达效能，表现为D抗原弱表现型。Wagner等［4］和Cowley等［11］分别提出了白种人RHD基因编码区发生的碱基突变是有Rh表型特异性的观点。Wagner等［4］所观察的弱DCcee样本中，82%带有T809G（弱D1型）或C8G（弱D3型）的特异型突变；所观察的弱DccEe样本中，96%带有G1154C（弱D2型）特异型突变。进一步分析发现，不具有上述3种突变的大多为部分D。他们所观察到的弱D15型个体的弱D基因存在于DcE单倍体中，而我们在中国人中发现的弱D15型个体有3种表型： CcEe（2例）、Ccee（ 2例）、ccEe（14例）。它们分别占弱D15 型的11%、11%、78%。RHD基因数目分析显示，18例标本中仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+，提示基因型为DCe/DcE，两条染色体上的弱D基因分别存在于DCe和DcE单倍体上；表型为Ccee的2例标本为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型是DCe/dce，弱D基因存在于DCe单倍体中；表型为ccEe的14例标本为杂合型RHD+/RHD-，提示基因型是DcE/dce，弱D基因存在于DcE单倍体中，其中弱D基因存在于DCe单倍体上的个例在国内外文献中均未见报道，本研究报告为首次报道。国内对弱D的系统研究报道很少，而在国际上目前经RHD全基因序列分析鉴定和GenBank登录的弱D型已达41种，白种人中大约有0.2%-1%带有弱表达的RhD抗原，其中弱D型1-4占95%，70.3%在第6外显子有1个点突变,造成第9跨膜区的V270G氨基酸替换,为弱D 1型；18.0%在第9外显子有1个点突变,造成第12跨膜区的G385A氨基酸替换，为弱D 2型。弱D15型少于1%［4］ 。我们在对中国汉族人群弱D的系列研究中，在多例弱D样本中发现18例弱D15，占D抗原弱阳性表型的56%(包括部分D),这是在中国人群中最主要的D弱表达型。对弱D进行深入研究的最终目的是为了探讨关于弱D型个体产生抗-D的风险及最适定型方式和输血策略。国外有弱D15型和弱D4.2型个体被免疫产生抗-D的病例报道［10］，尽管中国人群中未见关于弱D15型个体被免疫产生抗-D的报道，但由于我们在研究中发现弱D15型是中国人群最主要的D弱表达型，所以这个弱D型别应引起中国血型工作者的高度关注，在输血中，如是献血者，一定作为D阳性供者，如是受血者，需输注D阴性血。对中国人群弱D型的分布及分子遗传背景的系统研究，对建立中国人弱D型的相关输血策略，进一步保证临床输血的安全有重要意义。

　　致谢： 特别感谢深圳血液中心邵超鹏老师、熊文老师技术上给予的大力支持！

【参考文献】
  　　1 Avent ND， Reid ME. The Rh blood group system: a review. Blood,2000;95:375-387

　　2 Okuda H, Suganuma H, Tsudo N, et al. Sequence analysis of the spacer region between the RHD and RHCE genes. Biochem Biophys Res Commun,1999；263:378-380

　　3 Wagner FF， Flegel WA. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood，2000；95：3662-3668

　　4 Wagner FF,Gassner C,Muller TH,et al. Molecular basis of weak D phenotypes. Blood，1999；93:385-393

　　5 赵桐茂主编 . 人类血型遗传学. 北京:科学出版社,1987: 105-106

　　6 熊文，邵超鹏，周一炎. 中国人特异性的RHD基因定型方法的建立. 中国输血杂志, 2005； 18:4-7

　　7 邵超鹏，熊文. 一种新的RHD合子型直接测定方法. 中华医学杂志, 2004；84:736-739

　　8 Legler TJ，Maas JH，Kohler M，et al. RHD sequencing: a new tool for decision making on transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis.Transfus Med,2001；11:383-388

　　9 Wagner FF，Frohmajer A，Ladewig B，et al. Weak D alleles express distinct phenotypes. Blood， 2000；95：2699-2708

　　10 Flegel WA, Wangner FF. Molecular biology of partial D and weak D: implications for blood bank practice. Clin Lab,2002；48:53-59

　　11 Cowley NM, Saul A, Hyland CA. RHD gene mutation and weak D phenotype: an Australian blood donor study.Vox Sang，2000；79:251-252.

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