作者：吴俊杰，洪小珍，马开荣，许先国，傅启华，严力行
【摘要】 为了快速鉴定DEL表型，建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法，根据RHD 1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)，用于DEL表型的基因分型。用已知RHD 1227A多态性的样本和已知DEL表型的样本评价基因分型方法的灵敏度和特异性。结果表明：在50例RHD 1227A阳性和50例RHD 1227A阴性的Rh阴性样本中基因分型方法的灵敏度和特异性都是100％；在33例DEL阳性样本和89例DEL阴性的样本中，基因分型方法的灵敏度为100％，有2例样本血清学结果为阴性而基因分型结果为阳性，重新用血清学方法和序列分析方法复核这2例样本，发现2例都是血清学漏检，因而基因分型方法的特异性是100％。 结论： 设计的基因分型方法可以有效地鉴定浙江汉族Rh阴性人群中的DEL表型。
【关键词】 DEL表型； RHD 1227A等位基因； 基因分型
Establishment of Genotyping Method for DEL Phenotype in Zhejiang Han Population
Abstract In order to establish a genotyping method for DEL phenotype in Zhejiang Han population, an AS-PCR method was developed according to the RHD 1227A allele sequence. Its specificity and sensitivity were assessed in two Rh negative populations whose RHD 1227A or DEL phenotype status was known. The results showed that in evaluation of the method by detecting 50 RHD 1227A positive and 50 RHD 1227A negative individuals, the genotyping method displayed a sensitivity of 100% and a specificity of 100%; in evaluation of the method by detecting 33 DEL positive and 89 DEL negative individuals, the sensitivity was 100%, however, there were two serologically negative samples which were confirmed as positive using genotyping method. After re-testing these two samples with serological method and sequence analysis, it was found that original serological method gave false negative results and genotyping method still showed 100% specificity. The minimal target DNA concentration of this genotyping method is 8.13 ng/μl. In conclusion, designed genotyping method can be used to identify DEL phenotype efficiently in Zhejiang Han Rh negative population.
Key wordsDEL phenotype; RHD 1227A allele; Genotyping
Rh血型中D抗原在输血医学和产科学中意义最为显著。最近的研究发现，DEL表型（一种极弱表达的D抗原，只有通过吸收释放的方法才能检测到，称为DEL抗原）的血液输注给Rh阴性患者仍会产生抗D免疫反应［1］，因此，对DEL抗原的免疫原性应予以重视［2-4］。目前常用的血清学DEL表型鉴定方法由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，如何快速有效的鉴定DEL表型已成为一个具有重要临床意义的课题。我们的研究发现，浙江汉族DEL表型和RHD 1227A相关（未发表研究结果）。根据RHD 1227A等位基因序列，我们设计了1种AS-PCR方法，通过检测100例RHD 1227A多态性已知的Rh阴性样本和122例DEL表型已知的样本，对该方法用于浙江汉族Rh阴性人群中DEL表型基因分型的适用性进行评价。
材料和方法
对象
在浙江省居住或者工作的无亲缘关系Rh阴性汉族献血员222例，包括50例RHD 1227A阳性和50例RHD 1227A阴性（参照参考文献［5］，序列分析确定RHD 1227A位点的多态性）、33例DEL阳性和89例DEL阴性(DEL表型采用氯仿释放的方法鉴定，见参考文献［6］)。
Rh表型血清学鉴定
RhD表型鉴定采用常规盐水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D试剂。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体。
基因分型
根据RHD基因和RHD 1227A等位基因相关序列设计一组特异扩增RHD 1227A等位基因的引物：RHDEL-s: 5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3' （位置对应于AJ299028的68-85）、RHDEL-a: 5'-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3' （位置对应于AB035185的849-832）。1对特异扩增人生长激素基因429 bp的引物作为内对照，HGH-s： 5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3'; HGH-a： 5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3'。反应总体积10 μl，含模板DNA 0.2 μl（约含DNA 50-60 ng），特异性引物终浓度250 nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度 200 μmol/L，Taq酶0.2 U（TaKaRa公司产品）。PCR扩增条件： 95℃预变性5分钟，然后94℃ 变性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。
基因分型方法DNA浓度检测下限评估
将RHD 1227A阳性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司产品，德国）测得浓度，用RHD 1227A阴性的DNA作为稀释液，倍比稀释RHD 1227A阳性样本。稀释后DNA的PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。
结果
RHD 1227A多态性已知的Rh阴性人群
在100例Rh阴性人群中，用基因分型方法扩增50例RHD 1227A阳性样本，都可扩增得到867 bp的特异条带和429 bp的内对照条带，即结果都为阳性；扩增50例RHD 1227A阴性样本，都只能扩增出429 bp的内对照条带，即结果都为阴性。这表明基因分型方法在该群体中检测RHD 1227A的灵敏度和特异性都为100％。电泳图见图1。
浙江汉族Rh DEL表型的分子机理研究
GCSF的免疫调节作用及其在异基因造血干细胞移植中的应