转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究(1)-找论文网

作者：刘承利, 臧晓霞, 窦科峰, 朱帮福, 张洪义, 张宏义

【摘要】 目的研究转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的能力。方法以丝裂霉素C（MMC）处理高表达转m41BBL基因的小鼠Hepa16肝癌细胞，制成肿瘤细胞瘤苗（TCV），体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后，观察其对脾细胞产生细胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的影响。结果 TCV41BBL刺激后，脾细胞体外分泌细胞因子IL2、TNFα和GMCSF的水平明显增高。结论转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗能刺激脾细胞产生细胞因子IL2、TNFα和GMCSF。

【关键词】 小鼠41BBL; 共刺激分子; 肿瘤疫苗; 肝细胞癌; 细胞因子

　　　Abstract：Objective To study the cytokines production of spleen cells induced in vitro by murine 41BBL gene transfected Hepa16.Methods Murine hepatocellular carcinoma cell line Hepa16m41BBL which could highly express murine 41BBL was cultivated previously. The tumor cell vaccine (TCVm41BBL) was obtained by treating Hepa16m41BBL with mitomycin (MMC). Cocultivation TCV with syngeneic murine spleen cells and the supernatants were harvested for detecting the cytokines (IL2,TNFα and GMCSF).Results Comparing with TCVHepa16, high levels of IL2,TNFα and GMCSF were released by the spleen cells after stimulated by TCVm41BBL.Conclusion Stimulation signals delivered by 4BBL remarkably increased the production of IL2,TNFα and GMCSF.

　　Key words：murine 41BBL; Costimulatory molecule; Tumor cell vaccine; Hepatocellular carcinoma; Cytokines

　　0 引言

　　机体对肿瘤的免疫主要靠细胞免疫，特别是T细胞免疫。而T细胞的激活除了MHC抗原多肽复合物与T细胞受体（TCR）的结合所提供的第一信号外，共刺激分子（Costimulatory molecules）提供的第二信号也起着至关重要的作用 [1]。缺乏这些共刺激分子将导致T细胞进入克隆无能或凋亡。因此，将共刺激分子导入肿瘤细胞以制备肿瘤疫苗成为近来肿瘤生物治疗的研究热点。我们在研究中发现将小鼠肝癌细胞Hepa16中导入41BBL基因能明显增强其体内诱导机体产生免疫应答的能力 [2]，本文应用上述基因工程瘤苗研究了其体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的能力，以对其抗肿瘤机制作进一步的探讨。

　　1 材料及方法

　　1.1 材料

　　小鼠肝癌细胞株Hepa16由上海第二军医大学国际合作肿瘤研究所郭亚军教授惠赠，转m41BBL基因的高表达细胞株Hepa16m41BBL及转空载体的Hepa16neo为作者建立［3］，DMEM培养基为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品。大鼠抗小鼠41BBL抗体（BD公司产品）购自深圳晶美公司，羊抗大鼠IgGFITC、PHAP、MTT、DMSO为Sigma公司产品。丝裂霉素C（MMC）为 Kyowa Hakko Kkgyo 公司产品。TRIzol试剂及superscript Ⅱ反转录试剂盒为Invitrogen公司产品。Taq酶为华美公司产品。C57BL/6小鼠购自第四军医大学实验动物中心，6周龄，雌性。淋巴细胞分离液购自TBD生物技术发展中心。放线菌素Ｄ（ACD）为Fluka公司产品。IL2标准品、TNFα标准品、GMCSF标准品为第四军医大学生物技术中心及免疫教研室提供。L929细胞株、TF1细胞株为第四军医大学免疫教研室提供。引物由上海生工生物工程公司合成，根据GeneBank中m41BBL基因全长序列设计上游引物P1：5’GCGGATCCATGGACCAGCACACACTTGA3，下游引物P2：5’CGGATTCTCATTCCCATGGGTTGTCGG3’。预计扩增片段长度为945bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肿瘤细胞疫苗的制备

收集培养的Hepa16、Hepa16neo及Hepa16m41BBL细胞，1×PBS液洗2次，细胞数调至1×1010/L，用MMC（80mg/L）于37℃、50%CO2处理1h，1×PBS液洗3次，重悬细胞，制成肿瘤细胞疫苗备用 (分别称为TCVHepa16、TCVHepa16neo、TCVm41BBL)。

　　1.2.2 MMC处理前后转染细胞m41BBL表达的变化

取对数生长期的Hepa16m41BBL细胞稳定表达克隆，以1×105 /孔的浓度铺6孔板，培养48h后，1×PBS洗2次，用MMC（80mg/L）于37℃、50% CO2处理1h，1×PBS洗3次，重新加完全培养液培养，分别于作用前、作用后6h、24h、48h收集细胞提取总RNA，用于RTPCR检测。

　　1.2.3 C57BL/6小鼠脾细胞悬液制备及混合淋巴细胞培养

无菌取C57BL/6小鼠脾脏，无菌玻璃针芯研磨并过150目筛网，制备单细胞悬液， RPMI1640洗涤一次，以含10%新生牛血清的RPMI1640重悬细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，置 12孔培养板，分别加入培养液，TCVHepa16，TCVHepa16neo，TCVm41BBL，细胞浓度为 5×105 /ml(脾细胞与TCV比例20∶1)，37℃、50%CO2 培养36ｈ，离心收集培养上清，用于检测细胞因子。

　　1.2.4 IL2的测定

采用小鼠脾Ｔ母细胞的MTT法 [4]。无菌取C57BL/6小鼠脾脏，研磨，过150目钢网，0.87%氯化铵 (30～60s)溶解红细胞，PBS洗涤 3次，用含15μg/ml PHAP、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、10%新生牛血清的 1640培养液制成 1×107/ml细胞悬液，37℃、50%CO2培养48～72ｈ，细胞悬液用淋巴细胞分离液分离，1500r/min离心15min，取中间层淋巴细胞。PBS洗涤2次，计数，调细胞浓度为1×106/ml。取100μl的待测样品及稀释IL2标准品 (浓度为 100Ｕ/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照 (培养液)，每孔另加入上述细胞悬液各100μl，37℃、50% CO2 培养24ｈ，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，进行MTT检测。于 96孔培养板中每孔加入MTT 20μl，37℃、50% CO2 培养 4～6h，离心1000 r/min，5min，吸弃上清，每孔加入DMSO200μl，充分吹打混匀或过夜，于酶标分析仪上测定570nm的吸光度值(Ａ)。

计算公式：IL2活性单位=（达50 %最大Ａ值的样品稀释度/达50 %最大Ａ值的标准品稀释度）×标准品单位

共2页: 1 [2] 下一页

融合蛋白在肿瘤研究中的应用

用基因芯片研究乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40个氨基酸差