【摘要】 目的 用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白全长序列和X蛋白羧基端缺失40个氨基酸序列之间差异表达的基因，初步探索HBV相关的肝细胞癌发生的分子机制。方法 将20 228条 cDNA 用点样仪点在特制的玻片上制备成表达谱芯片，将带有乙型肝炎病毒HBx蛋白全长基因序列和HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸（HBx3’40）基因序列的pcDNA3（）的质粒分别转染肝癌细胞系Huh7，提取两株细胞的总RNA，逆转录为cRNA，用Cys3和Cy5两种荧光分别标记，与表达谱芯片杂交，通过计算机扫描和数据处理，筛选出差异表达的基因。结果 差异表达的基因有167条，其中上调基因145条，下调基因22条，包括原癌及抑癌基因、细胞周期和细胞凋亡相关基因、信号转导和免疫调节相关基因、细胞增殖和代谢及基因转录等相关编码基因。结论 运用cDNA 表达谱芯片分析基因表达的差异, 能快速筛选出HBx和HBx3’40之间差异表达的基因并高效率地对基因功能进行研究，为进一步研究HBV的致癌机制提供了理论依据。
【关键词】 cDNA芯片; 乙型肝炎X蛋白; 缺失; 基因; 差异表达
Identification of Differentially Expressed Genes in Hepatitis B Virus X Protein Cterminally Truncated 40 Amino Acids by cDNA Microarray
Abstract：Objective To investigate the differentially expressed genes of the full－length sequence of HBV X protein and the sequence of the HBV X protein deletion mutant cterminally truncated 40 amino acids by cDNA microarray analysis and to evaluate the molecular biological mechanisms of the hepatitis B virusmediated hepatocarcinogenesis. Methods Total RNAs were isolated from Huh7 cells transfected with pcDNA3() integrated the sequcece of HBx protein cterminally truncated 40 amino cids and pcDNA3() integrated the full length sequence of HBx protein vectors, then RNAs were reversely transcripted into cRNA and hybridized onto Agilent Genechip expression microarrays containing 20228 human cDNA. Analyses were performed to determine the different pattern of gene expression in the cells with full length HBx protein and HBx protein cterminally truncated 40 amino acids and the changes in the expression level by computer. Results Through this cDNA microarray we identified 167 differentially expressed genes and among those we further identified 145 upregulated and 22 downregulated genes and two novel human genes, the existing genes including oncogenes and tumor suppression genes, cell cycle and cell apoptosis genes, signal transduction and immune regulation genes, cell proliferation and metabolism genes, and gene transcriptionrelated genes. Conclusion Microarray technique is effective in screening the differentially expressed genes and exploring their function between two different kinds of Huh7 cells transfected with pcDNA3HBx and pcDNA3 HBx3’40 respectively. To investigate those obtained genes will be helpful to understand the molecular mechanism of hepatoma associated with HBV infection.
Key words：cDNA microarray; Hepatitis B virus X protein; Deletion; Gene; Differential expression
0 引言
HBx蛋白是一种广泛的反式作用因子，对多种细胞与病毒的增强子及启动子有反式激活作用, 参与细胞信号传导和转录调控，与肝细胞癌的形成和发展密切相关［1］，大量研究表明，HBx蛋白存在不同程度的缺失和突变，并且发现HBx蛋白变异在肿瘤组织比非肿瘤组织更为常见［2］。阐明HBx蛋白在HBV相关的肝细胞癌发生发展中的作用，对于肝细胞癌的防治具有重要意义。本研究应用含有20 228条人类全长和非全长基因的cDNA表达谱芯片，对转染有HBx全长蛋白和HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸基因序列的二株细胞进行相关基因的筛查，寻找HBx蛋白反式激活基因及其与肝细胞癌发生的关系，为研究HBV相关的肝细胞癌的形成机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料
肝癌细胞株Huh7(本室保存), HBx蛋白及HBx3’40蛋白的真核表达质粒pcDNA3()由本室构建。RNeasy Mini Kit(Qiagen)，酶标仪（Gene Spec V）,Lipofectamine PLUS转染试剂盒(Gibco)。Cy5 NTP和Cy3 NTP（PerkinElmer），Gasket slide、Hybridization Chamber、Human oligo microarray均购自Agilent公司。
1.2 总RNA提取及检测
将生长至对数期的Huh7细胞用脂质体转染试剂Lipofectamine PLUS分别转染pcDNA3()HBx3’40及pcDNA3()HBx（分别标记为实验组和对照组），细胞收获经筛选鉴定后，用RNeasy Mini Kit试剂盒,提取转染了重组表达质粒Huh7细胞的总RNA, 样品经QIAGEN RNeasyR Mini Kit（Affymetrix）纯化后用分光光度计检测吸光度,并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。
1.3 探针标记
将RNA逆转录为cDNA后，加入Cy3和Cy8制成cRNA探针并纯化。用Cy3dUTP标记实验组细胞RNA，用Cy5dUTP标记对照组细胞RNA。
1.4 芯片制备
cDNA表达谱芯片类型为AgilentG4110B，由上海生物芯片有限公司提供，包含20 034个人类基因cDNA,另外还设定了阳性对照114个，阴性对照20个，空白对照38个，内参照20个，每块芯片共计20 228个点。
1.5 杂交及洗涤
cRNA 探针经纯化和片段化后，与杂交缓冲液混匀，滴加在cDNA芯片上，盖上盖玻片置于杂交炉中，60℃滚动杂交16h。去掉盖玻片, 用SSPE和NLauroylsarcosine溶液洗涤1min×2, 然后用Stabilization and Drying Solution 溶液中洗30s，室温晾干。
1.6 检测与分析
芯片杂交结果采用Agilent 扫描仪进行扫描，Imagene软件读取数据。用Feature Extraction进行Normalize处理分析，最后用Ratio分析，Ratio值为cy3/cy5，即实验组/对照组。一般认为其值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。差异基因筛选标准为：ratio≥为上调基因，ratio0≤0.5为下调基因。
2 结果
2.1 总RNA的质量鉴定
提取转染了cDNA3()HBx3’40及 pcDNA3()HBx细胞的总RNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见18S和18S的清晰条带，并且28S条带的亮度和宽度为18S条带的2倍左右，见图1。紫外分光光度计检测，转染了缺失及全长HBx基因细胞的总RNA含量分别为4.66μｇ/μl和5.35μｇ/μl，吸光度A260/A280均大于1.90，说明所用总RNA的质量符合实验要求。
2.2 芯片杂交结果及分析
图2为转染了缺失及全长HBx基因细胞的cDNA表达双色荧光标记叠加图。实验组探针标记Cy3荧光素(呈红色),对照组探针标记Cy5荧光素(呈绿色),红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异，黄色代表实验组与对照组细胞表达水平相当。图3为杂交信号强度散点图,每个点代表了芯片上一个基因点的杂交信号;红点代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间,为非差异表达，黄点代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外,为表达差异。根据差异基因的筛选标准,共得到差异表达的基因有167条，其中上调基因145条，下调基因22条。在上调基因中还发现了2条未知的基因。
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