作者：龚莉,周铁军,陈鲜, 陈伟妍,陈宣世
【摘要】 目的 从蛋白水平探讨口腔鳞癌组织中肿瘤抑制基因PTEN的表达及临床病理意义。方法 应用SP免疫组化染色法和组织芯片技术，检测10例正常口腔粘膜、10例口腔上皮单纯增生、15例口腔粘膜白斑及72例OSCC（其中高分化30例、中分化26例、低分化16例）组织中PTEN蛋白的表达，同时分析PTEN的表达与患者临床病理资料的关系。结果 PTEN基因在口腔鳞癌、口腔粘膜白斑、口腔上皮单纯增生和正常口腔粘膜组织中的阳性率分别为72.2％（52/72）、93.3％(14/15)、100％(10/10)和100％(10/10)，口腔鳞癌组与其他各组间有显著性差异（P<0.05）；PTEN的阳性表达率在不同性别、年龄和TNM分期等临床病理参数间无显著性差异（P>0.05），但与淋巴结转移、组织分化程度等临床病理参数间有显著性差异（P<0.05）。结论 PTEN基因表达的下调在OSCC的发生、发展中起着重要作用，其表达的异常可作为判断预后的参考指标之一。
【关键词】 PTEN；口腔鳞癌； 组织芯片； 免疫组化
Expression of Tumor Suppressor Gene PTEN in Oral Squamous Cell Cancer Using Tissue Microarray Techniques
Abstract：Objective To explore expression of PTEN in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and its clinicopathological significance.Methods PTEN protein expression in paraffin embedded tissues from 10 cases of normal oral mucosa, 10 cases of oral epithelial hyperplasia,15 cases of oral leukoplakia and 72 cases of OSCC was analyzed by SP immunohistochemical method and tissue microarray techniques, meanwhile analysed clinical pathological data.Results The positive rate of PTEN protein was 72.2％（52/72）、93.3％(14/15)、100％(10/10) and 100％(10/10) in OSCC,oral leukoplakia,oral epithelial hyperplasia and normal oral mucosa，there was significant correlation among them（P<0.05）.PTEN expression was not obviously correlated with age, different gender, and TNM classification etc（P>0.05）,but there was significant correlation with nodal metastases and degree of OSCC（P<0.05）.Conclusion Loss of PTEN protein expression may play an important role on the tumorigenesis and development of OSCC, PTEN can be used as a reference marker for judging prognosis of patients with OSCC.
Key words：PTEN; OSCC; Tissue microarray techniques; Immunohistochemical method
0 引言
口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，其发生的机制尚不清楚。癌基因和抑癌基因的突变及表达异常在肿瘤的形成过程中起着重要的作用。新近发现的抑癌基因PTEN是第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，与多种恶性肿瘤的发生和发展有密切关系，其表达下调促进肿瘤发展，但PTEN与OSCC的关系尚未见报道。我们采用组织芯片和免疫组化技术检测PTEN在OSCC中的表达情况，探讨PTEN在OSCC发生、发展及转移中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集泸州医学院病理学教研室1999～2004年72例口腔鳞癌手术存档石蜡标本，并随机选取10例正常口腔粘膜、10例口腔上皮单纯增生及15例口腔粘膜白斑的石蜡标本。所有病例均为首次发病，术前均未接受放疗、化疗。患者男49例，女23例；年龄在22～86岁之间，中位年龄58岁。其中淋巴结转移37例，无淋巴结转移35例。所有标本均经10％中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
1.2 试剂与方法
1.2.1 组织芯片的制备
采用手工制作芯片。（1）定位：由两位高年资病理医师进行筛选，找出肿瘤组织中具有代表性的区域，并在相应的石蜡块上做出标记。（2）微阵列蜡块的制作：先制作空白受体蜡块。采用包埋框方法制出直径为1.8mm，间距为2mm，横向编号为1～7，纵向为A～F，共42个小孔的空白受体蜡块。然后用一内径为1.7mm空针头依次在上述标记好的蜡块上钻取组织，依次放入空白受体蜡块中。将构建好的阵列蜡块放入模具中，再放入二次包埋仪中进行二次包埋制出微阵列蜡块。（3）切片，裱片：将制作好的组织微阵列蜡块重新切片，厚度为4μm。将切片裱于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，制成组织芯片。共制作微阵列3个包含123个组织样本，有16个重复标本。
1.2.2 免疫组化染色
采用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物霉连接法（SP法），即用型鼠抗人单克隆PTEN抗体、SP试剂盒、DAB显色剂均购至北京中杉公司。严格按试剂盒说明书方法染色，所有切片染色均在相同条件下进行。用PBS液代替一抗做阴性对照，用已知阳性前列腺组织切片做阳性对照。
1.3 结果判断
所有免疫组化染色结果均由两位病理医师在不知病例资料的情况下盲法阅片判断，对每张切片至少在高倍镜（×400）下观察10个不重复视野来判断结果。PTEN蛋白表达的阳性部位在细胞核。参照Salvesen 等的标准采用半定量的方法将染色强度分为4级：不着色为0分；黄色为1分；棕黄色为2分；黄褐色为3分。将阳性细胞的比例也分为4级：阳性细胞数<10%为0分；10％～40％为1分；40％～70％为2分；≥70%为3分。两种评分相加，0～1分为（－）；2分为（＋）；3～4分为（＋＋）；5～6分为（＋＋＋）。统计时（－）为阴性，其余为阳性。
1.4 统计方法
应用SPSS11.5统计软件进行分析，实验数据率的比较采用χ2检验。
用基因芯片研究乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40个氨基酸差
应用蛋白质组学方法研究大肠癌分化相关蛋白