1.3 MALDITOF肽质指纹图分析及蛋白质库搜寻鉴定
将样品酶解、脱盐后进行质谱分析，用Mascot软件（Matrix science Ltd.,UK）中的串联质谱数据库搜寻（MS/MS Ion Search）功能进行搜索。
免疫组织化学：将组织切片脱蜡至水，H202处理，在枸橼酸/枸橼酸钠抗原修复液中进行组织抗原微波修复；依次滴加正常血清及一抗（HSP27），按免疫组化SP法完成，DAB显色，Mayer苏木精复染。用PBS液代替一抗作为空白对照；用公司提供阳性切片作为对照。阳性信号定位于细胞浆，细胞浆中可见棕黄色或棕褐色颗粒。根据阳性细胞在全部癌细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果 [8]。
2 结果
2.1 双向凝胶电泳结果
对5例高分化腺癌和5例低分化腺癌和与之相对应的癌旁正常粘膜进行了2－DE，蛋白质斑点清晰可辨。高、低分化大肠癌组和癌旁正常粘膜的大部分蛋白斑点均位于分子量20～90kd、pH4～8的区域，特别是30～85kd、pH 4.5～7.7区域。与正常组相比，高分化癌组中特异表达或表达上调超过5倍的蛋白点出现8个，低分化癌组中有特异表达或表达上调超过5倍的蛋白点出现7个。在这8个和7个蛋白特异点中，有4个蛋白点位置基本相同，说明它们在高、低分化癌组中均有特异表达，可作为大肠癌高低分化组织中共同的特异性标志物。为了鉴定这些蛋白质，我们在显示清晰的凝胶上将上述差异蛋白点切下，进行了质谱分析和网上鉴定，见图1。
2.2 质谱鉴定结果
将寻找到的特异蛋白和表达增加超过5倍以上的蛋白斑点进行了质谱分析和数据库鉴定，发现在高、低分化癌组中均有特异表达或升高的蛋白有4个：calreticulin precursor（钙网硬蛋白前体）、O98007, MHC class I antigen蛋白类似物（主要组织相容性复合体的片段）、AAH10915蛋白、AAH75839蛋白。在高分化癌组中高表达的4个蛋白，包括热休克蛋白27序列、微管蛋白β链、丙糖磷酸异构酶、肝脂肪酸结合蛋白。在低分化癌组中有特异表达或升高的蛋白3个，包括氧合血红蛋白突变体；锌指蛋白312类似物；Fragment类似物。
2.3 免疫组化验证结果
HSP27在分化程度不同的大肠癌组织中表达的免疫组织化学结果显示，HSP27在高分化大肠癌组织中的阳性表达率显著高于其在低分化大肠癌组织中的阳性表达率，与蛋白质组学筛选结果基本一致，见图2。表1 大肠癌高、低分化组中HSP27的表达（略）
3 讨论
蛋白质组学方法的不断完善使有效研究基因功能成为可能。已有报道蛋白质组学技术应用于大肠癌研究。Stulik等 [4]采用双向凝胶电泳分析了23例大肠癌组织和正常粘膜组织之间的蛋白质组表达差异，发现癌组织中的一种钙结合蛋白S100A9表达显著上调。Stierum等 [3]报道应用双向电泳和质谱分析了大肠癌Caco2细胞系蛋白质组表达，发现有18种蛋白质与其增殖和分化有关。
一般认为，肿瘤分化程度越差，恶性程度就越高，分化程度对肿瘤生物学特征，如生长速度、侵袭转移、预后等有重要影响，故阐明大肠癌不同分化程度形成的机制在大肠癌预后预测、个体化治疗中意义重大。将筛选的差异蛋白分为4类：第1类与肿瘤细胞的发生、增殖和分裂有关，如热休克蛋白、微管蛋白、锌指蛋白312类似物。热休克蛋白（HSP）是一类与机体应激反应相关的蛋白家族，有保护细胞内部动态平衡以及抗肿瘤功能 [5，6]。通过临床病理标本的免疫组化进一步研究，初步确定HSP27在高分化腺癌中表达更强，具体机制还有待进一步研究。锌指蛋白可以协助完成细胞的许多功能，如细胞分裂、分化等 [7]。有人报道在80%以上的大肠癌中有锌指蛋白高表达，本实验中发现锌指蛋白在低分化组中特异表达，可能与其在大肠肿瘤中促进分裂、增殖等功能有关。第2类蛋白与肿瘤细胞的能量代谢有关，如丙糖磷酸异构酶、肝脂肪酸结合蛋白、氧化血红蛋白突变体；第3类与组织相容性抗原有关，如O98007和Q9TQL5蛋白片段；第4类蛋白的作用不明，如钙网硬蛋白前体、AAH10915和AAH75839蛋白等。第2类蛋白的特异表达或表达增强可能与肿瘤细胞的增殖、分裂和能量代谢比较活跃的状态有关，而丙糖磷酸异构酶、肝脂肪酸结合蛋白在高分化组表达上调而在低分化组上调不明显，可能与低分化肿瘤组织主要以无氧糖酵解的方式进行能量供应相适应，还可能因为低分化肿瘤细胞的蛋白质分解速度高于蛋白质的合成速度。第3类中与组织相容性抗原有关的蛋白，推测是因为在大肠肿瘤发生和发展过程中，存在着机体对肿瘤组织的免疫攻击和肿瘤细胞的免疫逃避二者共同作用而引起肿瘤组织的组织相容性抗原发生变化。第4类蛋白因为在数据库中还没有很好的进行功能鉴定，有待进一步研究。本实验结果与以往的报道对照，有的蛋白其功能得到了肯定，也有的蛋白表达的功能不能肯定，不排除样本量的因素和实验误差的原因，还需要进一步的研究来验证
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应用自制组织芯片研究抑癌基因PTEN在口腔鳞癌中的表达
一种新的重组腺病毒载体pAdBM5GFPmAFP的构建