作者：马向涛，余力伟，王杉，张在兴，杜如昱，崔志荣
【摘要】 目的 转录信号转导子与激活子3（Signal transducers and activators of transcription 3, Stat3）通路受细胞因子与生长因子的刺激而活化，参与调节细胞的增殖、分化与凋亡，探讨Stat3反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法 用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌HCT116细胞，MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；Western blot检测Stat3、磷酸化Stat3及凋亡家族成员bcl2、bclxL、Mcl1、Caspase3的表达。结果 转染Stat3反义寡核苷酸后HCT116细胞增殖受抑制，凋亡细胞增多，Stat3、pStat3与bcl2家族成员表达水平下降。结论 Stat3信号转导通路活性增高可能与结肠癌发生发展有关，阻断Stat3通路可以诱导结肠癌细胞凋亡。
【关键词】 结肠癌；信号转导通路；增殖；凋亡
Stat3 Signaling Pathway Regulates the Expression of bcl2 Family Members and Promotes Survival of Human Colon Cancer Cells
Abstract：Objective Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) is activated in response to cytokines and growth factors stimulation, and activation of Stat3 is involved in modulating cell proliferation, differentiation and apoptosis. The purpose of the study was to examine colon cancer cell lines to determine whether Stat3 plays an important role in the process of apoptosis in colon cancer cells. Methods Protein lysates were extracted from colon cancer cells. Human colon cancer cell line HCT116 was transfected with Stat3 antisense oligonucleotide mediated by liposome, MTT assay was used to measure the proliferation, flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and apoptosis, the expression of Stat3, pStat3, bcl2, bclxL, Mcl1 and Caspase3 were measured by western blot. Results Targeting of Stat3 using antisense oligonucleotide directed against the translation site, resulted in apoptosis and downregulation of Stat3, pStat3 and bcl2 family members. Conclusion Constitutive activation of Stat3 is associated with the carcinogenesis of colon cancer cells. Blocking of Stat3 signaling could induce apoptosis of colon cancer cells.
Key words：Colon neoplasm；Signal transduction pathway；Proliferation；Apoptosis
0 引言
Stat3是转录信号传导子与激活子通路（Signal Transducers and Activators of Transcription，STATs）的重要成员，该通路接受生长因子与细胞因子等细胞外信号刺激，调节细胞增殖、分化及凋亡[1]。目前已发现Stat3在白血病、胃癌、头颈部鳞癌及乳腺癌等多种肿瘤组织及细胞系中呈持续活化[25]，但是关于Stat3在调控结肠癌细胞凋亡过程中的作用还有待进一步研究。本研究应用Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌细胞，探讨Stat3信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
结肠癌细胞HCT116由北京大学人民医院外科肿瘤研究室保存，培养于含有10%胎牛血清（美国HyClone公司）的RPMI1640培养基（美国GIBCOL/BRL公司）。
1.2 Stat3寡核苷酸的合成与纯化
Stat3反义寡核苷酸根据Stat3翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在GenBank数据库进行同源性检索，未发现同源序列。Stat3反义寡核苷酸序列：5′CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3′；Stat3正义寡核苷酸序列：5′AGA AACAGGATGGCCCAATGG 3′；Stat3错配寡核苷酸序列：5′ CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3′。以上寡核苷酸由美国Santa Cruz公司合成及纯化。
1.3 阳离子脂质体转染
阳离子脂质体Lipofect Amine2000（美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。
1.4 细胞增殖状态检测（MTT法）
取第3～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达95%，按每孔4.0×105个细胞接种于96孔板中，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。实验分为以下4组：（1）空白对照加无血清培养组；（2）正义寡核苷酸组；（3）错配寡核苷酸组；（4）反义寡核苷酸组，每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，浓度分别为0、5、10、20μM，第0、24、48、72h分别加入MTT 5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200ml，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线，见图1。
1.5 细胞周期检测
细胞同步化后分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50mg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI（美国Sigma公司）至终浓度50mg/ml，4℃避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。
1.6 细胞凋亡检测
同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，PBS离心洗涤2次，200ml结合缓冲液重悬，加入ANNEXTIN VFITC至终浓度1mg/ml，加入PI至终浓度2.5mg/ml，室温避光染色15min，上流式细胞仪检测。
1.7 Western blot
参照Santa Cruz公司提供的蛋白提取方法，分别裂解结肠癌细胞与组织得到总蛋白。以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司）手册绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测吸光值，计算出提取液的蛋白浓度。取总蛋白50μg，7.5%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，封闭后，加入一抗Stat3、pStat3、bcl2、bclxL、Mcl1、Caspase3抗体（美国Santa Cruz公司），工作浓度1∶1000，GAPDH 作为内参照，辣根过氧化物酶结合的二抗，工作浓度1∶1000。用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。
1.8 吸光度测定
用PhosphoImager图像分析仪（美国Molecular Dynamics公司）测定条带的吸光度（A值），以A值代表蛋白的相对表达量。
1.9 统计学方法
应用SPSS12.0统计学软件，采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Stat3反义寡核苷酸可以抑制结肠癌细胞增殖
Stat3反义寡核苷酸作用HCT116细胞72h后，G1期细胞比率由68.9%上升至85.6%，S期细胞比率由15.4%下降至7.6%，细胞增殖受抑制，见图2。
2.2 Stat3反义寡核苷酸可以促进结肠癌细胞凋亡
HCT116细胞在转染Stat3反义寡核苷酸72h后，凋亡细胞百分比由5.6%增加至27.5%，见图3。
2.3 Stat3反义寡核苷酸可以使Stat3信号传导通路成员活性与表达下降
HCT116细胞转染Stat3反义寡核苷酸72h后，Stat3蛋白表达与活性下调，其靶基因产物bcl2成员表达下降，见图4。
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