作者：平浩， 张军晖，陈晓春， 鲁功成
【摘要】 目的 研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。 方法 在脂质体介导下将针对hTERT 基因的shRNA表达载体psilencerTRT转染前列腺癌细胞PC3m，得到稳定细胞株PC3m/shRNATRT。采用RTPCR检测hTERT基因表达情况，western blot分析各组细胞hTERT及cmyc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 重组质粒psilencerTRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调，抑制率约为89.02%；同时实验组细胞hTERT及cmyc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（P<0.05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为(19.69±4.75)％。 结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。
【关键词】 端粒酶逆转录酶； 短发夹状RNA； 前列腺癌； 凋亡
RNA干扰是近几年发现和发展起来的一项新的基因阻断技术，由于其具有高效的抑制作用，已广泛应用于医学的多个领域[1]。人端粒酶逆转录酶基因编码的端粒酶催化亚单位在大多数肿瘤中表达上调并对肿瘤细胞的端粒酶活性起重要调控作用，是目前肿瘤基因治疗中一个极具前景的靶点[2]。因此，本研究拟通过转染针对端粒酶hTERT的siRNA表达载体，使其在前列腺癌细胞PC3m内稳定产生特异性的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)，诱导RNA干扰，并探讨shRNA对hTERT、cmyc 表达及细胞增殖和凋亡的影响，寻找新的前列腺癌基因治疗方法。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
质粒psilencer2.1U6neo购自美国Ambion公司。AnnexinⅤFITC试剂盒购自晶美生物技术有限公司。
1.2 shRNA表达载体的构建及鉴定
本实验应用本组已成功构建的重组质粒psilencerTRT[3]，其合成步骤大致如下：针对hTERT基因靶点（TTTCATCAGCAAGTTTGGA）合成两条寡核苷酸链，它包括两端的BamHI和HindIII酶切位点及反向的两个一致的靶序列，被9bp的非同源序列的环间隔，3’末端加有TTTTTT终止序列。该正反两条寡核苷酸链退火得到双链DNA，并将该退火siRNA目的片段插入到psilencer2.1U6载体中，连接产物psilencerTRT转化宿主菌DH5α并行测序鉴定；阴性对照质粒psilencerNC由人和鼠的非同源性靶序列构建合成。
1.3 细胞培养及稳定转染
人前列腺癌细胞株PC3m接种于6孔板，在含10%小牛血清的DMEM培养基中生长至50%～70%融合。采用脂质体转染法稳定转染抑制质粒psilencerTRT和对照质粒psilencerNC，按照转染试剂盒说明书提供的步骤进行，将重组质粒与脂质体1∶3混合，G418筛选阳性细胞克隆并进行实验分组，转染psilencerTRT质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNATRT（实验组），转染psilencerNC质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNANC（阴性对照组）。未转染质粒的亲本细胞PC3m作为空白对照组。
1.4 RTPCR检测hTERT mRNA的表达水平
收集细胞，提取细胞总RNA，MMLV逆转录酶进行反转录，相应PCR反应体系中进行扩增， PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线透射仪下观察拍照并行条带灰度分析，hTERT与βactin灰度的比值即为hTERT mRNA相对量A值。
抑制率＝A实验组/A阴性对照组×100%
1.5 Western blot检测hTERT、cmyc蛋白表达
收集细胞后加入预冷的裂解缓冲液，离心取上清，二喹啉甲酸法测定蛋白含量。以等量蛋白上样，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，电转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭，并分别加入一抗及二抗，碱性磷酸酶系统显色，同时βactin蛋白作为内参照。
1.6 细胞生长曲线测定
将PC3m细胞及稳定表达G418抗性的转染细胞以1×104/ml的浓度接种于24孔板中，每隔24h对每组细胞的3个孔进行消化，显微镜下计数，取平均值，共测5个时间点，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。
1.7 荧光染色观察细胞凋亡
采用Hoechst33258染色法观察凋亡细胞形态。培养后收集各组细胞， 4°C固定5min，加入Hoechst33258染色液（1∶20），荧光显微镜下观察拍照。
1.8 透射电镜观察细胞形态
收集细胞后，Dhanks缓冲液清洗2次，以2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋，超薄切片，铀铅染色，透射电镜下观察照相。
1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡
采用AnnexinⅤFITC和PI双染色流式细胞仪法，具体步骤按试剂说明书进行，流式细胞仪检测488nm波长处吸光度值。
1.10 统计学方法
应用SPSS11.5统计分析软件进行t检验。
2 结果
2.1 质粒psilencerTRT的鉴定结果
核酸序列分析结果可证实，shRNA表达载体psilencerTRT构建成功，测序结果与设计的完全一致，见图1。
2.2 各组细胞中hTERT mRNA表达水平
琼脂糖凝胶电泳上，各组均可见明亮的内参照βactin的扩增条带，空白对照组PC3m细胞和阴性对照组PC3m/shRNANC细胞hTERT条带较明亮，两者hTERT mRNA的量基本一致，hTRT/βactin比值（A）分别为0.84±0.16和0.82±0.13，两者比较无显著性差异（P>0.05）；实验组PC3m/shRNATRT细胞中hTERT mRNA表达水平明显降低，A值为0.09±0.04，抑制率为89.02%，与阴性对照组和空白对照组比较差异有显著性（P<0.01），见图2。
1: DNA marker DL2000; 2: PC3m; 3:PC3m/shRNANC; 4: PC3m/shRNATRT
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