作者：黄锦，林菊生，常莹，周秀敏
【摘要】 目的 构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法 根据PEG10基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNAhH1neo中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论 本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体，可能成为肝癌基因治疗中的一种新型、高效的治疗载体。
【关键词】 遗传印记基因；PEG10；siRNA；真核表达载体；鉴定
原发性肝细胞癌基因治疗面临的一大难题，是寻找参与绝大多数肝癌发病关键性的特异分子靶。PEG10（Paternally expressed gene 10）是2001年Ryuichi Ono等用cDNA微阵列在肝细胞癌组织中发现的一个新的遗传印记基因，它在肝癌中表达的特异性提示可能参与肿瘤细胞生长失控[1]。本研究采用分子克隆技术，构建了针对PEG10的siRNA真核表达载体，通过酶切鉴定和测序鉴定鉴定其结构。
1 材料与方法
1.1 材料 质粒psiRNAhH1neo购自美国InvivoGen公司，受体菌E.coli DH5α由本实验室保存。限制性内切酶BbsⅠ和AseⅠ及T4DNA连接酶购自美国NEB公司，MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂Rnasin和Taq聚合酶为美国Promega公司产品。高纯质粒提取试剂盒购自杭州Vgene公司，DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。DNA由上海生工生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 siRNA靶序列的设计和筛选 利用NCBI Genbank检索PEG10 mRNA的全长序列，参照siRNA设计原则，并运用RNA structure软件模拟靶mRNA的二级结构，尽量避免自身结合的茎区，选择配对区域较少的序列，如线区和环区。筛选出4个21个核苷酸的序列，分别命名为psiRNA1 （GCAGAAGCTCACAGAGGAGAA）、psiRNA2 (GCACAACTACCCAGCTTTCAT)、psiRNA3 (GGCAGTGCATTCACATTGAGA)和psiRNA4 (GTTCGATGGCAACCCAGACAT)。两端均引入BbsⅠ酶切位点。
1.2.2 靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建
1.2.2.1 shRNA表达模板的制备 将化学合成的正义链和反义链退火，形成shRNA表达模板，表达模板由正义链＋loop（CCACC）＋反义链组成，两端为酶切位点。
1.2.2.2 psiRNAhH1neo载体酶切 Invivogen公司psiRNAhH1neo质粒，H1启动子下游有两个BbsⅠ酶切位点，酶切反应后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收2 640bp片断，实验步骤按照华舜DNA凝胶回收试剂盒说明书操作。回收后通过紫外分光光度计定量。
1.2.2.3 连接及转化 将shRNA表达模板和psiRNAhH1neo酶切产物按4∶1的比例混合，T4DNA 连接酶27℃连接过夜，转化感受态DH5α大肠杆菌中，取振摇后的转化菌，均匀涂抹在含χgal和IPTG的卡那琼脂平板上，倒置培养过夜。观察菌落生长情况，蓝白斑筛选，挑取白色单克隆。
1.2.2.4 质粒的扩增和提取 将挑取的菌落分别接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、250r/min振摇12～14h。取3ml转化菌液，按照Vgene公司超纯质粒抽提试剂盒说明书步骤提取质粒，取1μl在1％的琼脂糖电泳，通过灰度扫描定量。
1.2.2.5 质粒的鉴定 ①酶切鉴定：将提取的重组质粒和psiRNAhH1neo空质粒，用限制性内切酶AseⅠ进行酶切鉴定。 ②测序鉴定： 取1ml转化菌液，送上海英骏生物技术公司进行测序鉴定。测序引物：5’CCCTAACTGACACACATTCC3’，测序方法为反向测序。
2 结果
2.1 重组载体酶切鉴定结果 用AseⅠ分别酶切重组载体和空载体，见图1，重组质粒酶切后呈线性化，电泳出一条带；空质粒组得到752bp和2 227bp两条带；未经酶切的质粒分别为电泳出超螺旋环状DNA、线状DNA、切口环状DNA三条带。以上结果均与预期相符。
1. psiRNAhH1neo AseⅠ; 2. psiRNA1 AseⅠ;3. psiRNA1 Lane; 4. psiRNA2 AseⅠ; 5. psiRNA2;6. psiRNA3 AseⅠ;7. psiRNA3; 8. psiRNA4 AseⅠ;9. psiRNA4; M. Marker Ⅲ图1 重组质粒酶切鉴定结果
2.2 测序结果 将DNA测序结果通过DNAssist 2.2软件进行比对，与预先设计结果完全相符。说明已将4个不同序列的siRNA分别成功克隆至载体psiRNA上，可以用于后续研究。
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