作者：方武,李文威,高淑华,邓和鸣,李香普
【摘要】 目的 了解姜黄素对p300表达的影响，探讨其抗膀胱癌的机制。方法 用不同浓度的姜黄素作用膀胱癌细胞T24，MTT法检测细胞增殖抑制率,RTPCR法检测p300、cfos、cjun的mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、cfos、cjun、p300蛋白表达。结果 姜黄素能抑制T24细胞增殖，且具有量效关系和时效关系。姜黄素能抑制 p300、cfos、cjun mRNA和蛋白的表达，抑制组蛋白H3、H4的乙酰化，也具有量效关系。结论 姜黄素可以抑制p300的表达，此可能是姜黄素抗膀胱癌的机制之一。
【关键词】 姜黄素； p300； cfos； cjun
姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄中提取出来的一种酚类色素, 具有抗癌作用。姜黄素可以通过多条途径发挥抗癌作用，如下调癌基因的表达，上调抑癌基因的表达,但是其具体机制还不清楚。p300蛋白具有调节基因表达和细胞增殖的作用。Karanam B等[1]报道姜黄素可以抑制p300/CBP的表达和活性，调节基因的表达，目前国内尚未见姜黄素对膀胱癌p300影响的报道。因此，本实验试图研究姜黄素对膀胱癌细胞T24的p300表达的影响，及其对乙酰化组蛋白H3、H4、原癌基因cfos、cjun的表达影响，从组蛋白乙酰化与基因的表达和调控的角度初步探讨姜黄素抗膀胱癌的机制。
1 材料与方法
1.1 药物 姜黄素（Sigma公司产品）用DMSO稀释成1×105 μmol/L置于-20℃保存,临用前解冻，处理细胞时加入到10% FBS的DMEM培养液中。
1.2 细胞培养及处理 人膀胱癌细胞系T24，移形细胞癌,购自上海细胞所;用含10%小牛血清的DMEM培养液,在37℃、5% ＣＯ2及饱和湿度下培养, 48h换液一次。取对数生长期细胞进行实验。
1.3 MTT比色实验 1×104细胞接种于96孔培养板中,培养24h后，按实验要求分别在T24细胞中加入终浓度为0、15、30、45 μmol/L的姜黄素, 0μmol/L即为对照组，每组3复孔。分别培养12、24、48、72h后,应用ELX 800型酶标仪(美国BioTek公司),进行MTT检测，波长为560 nm,根据MTT的吸光度(A)值,计算出MTT细胞增殖抑制率：
增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%
1.4 RTPCR法检测p300、cfos、cjun的mRNA的表达 用RNA提取试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工）提取RNA和反转录为cDNA，再经PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，结果用AlphaImager3400型凝胶图像分析仪(美国Alpha Innotech公司产品)照相并分析。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。每个实验重复3次。引物序列及反应条件，见表1。表1 各反应引物的序列和反应条件
1.5 免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、p300、cfos、cjun的表达 按实验分组要求收集细胞,加入三去污裂解液进行细胞裂解，于4℃离心10min,弃除沉淀，BCA法进行蛋白定量，取50μg蛋白加入4×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热10min以使蛋白质变性。用6% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转PVDF膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白分子量标准位置。5%脱脂牛奶封闭2h按1∶200加入羊抗人乙酰化组蛋白H3(Lys9)、H4(Lys8)抗体(基因公司)、羊抗人p300多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），βactin 抗体(Santa Cruz公司), cfos和cjun鼠抗人单克隆抗体（北京中山生物技术公司），室温孵育2h，TBST洗3次，1∶2000加入辣根过氧化物酶标记兔抗羊、兔抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST洗3次，用Western blot印迹荧光检测试剂盒显示于X线片。用AlphaImager3400型凝胶图像分析仪(美国Alpha Innotech公司)对胶片扫描和分析。每个实验重复3次。
1.6 统计学处理 数据以±s, 采用SSPS10.0进行单向方差分析，组间比较t检验。
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