非小细胞肺癌中hMLH1启动子的甲基化(1)-找论文网

【摘要】 目的探讨在非小细胞肺癌（NSCLC）中DNA修复基因hMLH1启动子甲基化与基因转录失活的关系，观察5AzaCdR的干预作用。方法甲基化特异的PCR(methylspecific PCR,MSP)和RTPCR法分别测定基因的甲基化率和转录水平。结果 NSCLC癌/癌旁组织中的甲基化率分别是hMLH1为55%和14%；>65岁组hMLH1甲基化率明显高于≤65岁组(P<0.01),hMLH1甲基化率随吸烟指数增高而升高(P<0.05或P<0.01)；hMLH1的甲基化率随TNM临床分期进展而逐渐增加（P<0.05或P<0.01）。甲基化的NSCLC标本hMLH1基因mRNA转录下降或失活，在细胞株水平5AzaCdR处理后hMLH1恢复转录活性。结论启动子甲基化是调节hMLH1转录活性的重要机制，5AzaCDR具有逆转甲基化而恢复转录的作用。

【关键词】 非小细胞肺癌 hMLH1 mRNA转录去甲基化

人类mut1同源物（Human mutl homolog 1,hMLH1)通过矫正错配变异的DNA恢复基因的正常功能而发挥抑癌基因的作用,hMLH1基因的变异将导致一系列恶性肿瘤的发病率上升。许多学者研究表明hMLH1在NSCLC中经常表达缺失，提示hMLH1在NSCLC发生发展中发挥重要作用。

本研究拟通过测定hMLH1在49例NSCLC中的甲基化状态与转录活性，探讨启动子甲基化与转录之间的关系，并观察去甲基化试剂5AzaCdR(5azadeoxycytidine，5杂糖胞苷)在体外干预的作用，探讨hMLH1在NSCLC中的作用。

1资料与方法

1.1研究对象

所有病例均为2003年3月～2003年9月在中山医院胸外科进行手术切除的NSCLC患者，癌旁标本为离肿瘤5cm远处的肺组织，标本获取后立即放置到-70℃低温冰箱中。49例NSCLC患者年龄在31～77岁，平均年龄为56±11岁，其中男34例，女15例，有吸烟史者30例，无吸烟史者19例，腺癌23例，鳞癌26例，临床分期按照1997年TNM分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ期18例、Ⅱ期16例、Ⅲ期15例。NSCLC细胞株购自中国科学院上海细胞所，分别为A549、SH77、SPCA1，37℃复苏、培养及传代。

1.2实验试剂

PCR的Faststart TaqDNA聚合酶购自Roche公司，T4连接酶、pGEMT载体购自Promega公司，测序试剂盒购自上海申能博彩公司；所有引物均由上海生工合成。hMLH1甲基化引物上游5′ ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC3′，下游5′ CCTCATCGTAACTACCCGCG3′，产物124bp；去甲基化引物上游5′TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT3′,下游5′ACCACCTCATCATAACTACCCACA3′,产物118bp；RT PCR的引物：hMLH1上游5′ GTGCTGGCAATCAGGGACCC3′,下游5′CACGGTTGAGGCATTGGGTAG3′,215bp;βactin上游5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′,下游5 TCAAGTTGGGGGACAAAAAG 3′，产物616bp。

1.3实验方法

1.3.1抽提组织DNA和RNA并反转cDNA

1.3.2基因组DNA的甲基化处理及MSP反应每管加入2μl dNTP、2μl Buffer、15μl ddH2O、0.75UTaq酶混匀后加入甲基化/去甲基化引物各2μl和1μl DNA模板；预变性5min，进入35个循环：变性30s→退火30s→延伸30s，连接5min。电泳后割胶回收测序。

1.3.3RTPCR反应条件 94℃预变性5min，进入35个循环：变性60s→退火60s→延伸60s，在第13个循环加入βactin，最后连接5min。

1.3.4PCR产物回收测序 ① PCR产物的回收纯化:按照上海博彩公司的测序试剂盒进行PCR产物的回收测序。② 应用氯化钙法制备新鲜感受态细胞，构建PCR的重组体涂于氨苄青霉素抗性中培养，经PCR检测鉴定后阳性克隆送搏彩公司测序。

1.3.5取5×106个细胞在5% CO2、37℃的RPMI1640培养液（含100U/ml青霉素 +100μg/ml链霉素）中培养24h后加入5AzaCdR 2μg/ml，2天更换一次培养液，共育8d后收割细胞，提取RNA后测定转录水平。

1.4统计方法

采用SPSS10.0统计软件，甲基化率的比较采用χ2分析，P<0.05有统计学差异。

2结果

2.1hMLH1甲基化与NSCLC患者年龄、吸烟史、病理类型及TNM临床分期的关系

hMLH1在NSCLC癌组织中的甲基化率55%（27/49）明显高于癌旁组织14%（7/49）(P＜0.001)；hMLH1甲基化率>65岁组93.3%(14/15)明显高于≤65岁组38%(13/34) (P＜0.001)；hMLH1的甲基化率在吸烟指数>400年支组100%（14/14）高于吸烟指数≤400年支组56%（9/16）（P=0.006），而后者高于无吸烟史组21%（4/19）（P=0.036）；腺癌的甲基化率48%（11/23）而鳞癌为62%（16/26），两者比较无差异（P=0.250）；临床Ⅲ期的甲基化率100%（15/15）高于 I 期56%（9/16）（P=0.004）， I 期的甲基化率高于Ⅱ期17%（3/18）（P=0.019）。

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