2.2hMLH1基因MSP电泳条带测序
目的条带测序结果证实了甲基化的胞嘧啶（C）由于甲基（CH3）的保护在亚硫酸处理后无变化，而去甲基化的C则转变为胸腺嘧啶（T），证实本实验所应用的MSP获得的PCR产物是可靠的，见图1。
2.3NSCLC癌组织hMLH1甲基化与mRNA转录之间的关系
在49例NSCLC癌组织标本中有37例转录失活或与癌旁组织相比转录水平下降，比例高达75.51%，其中27例存在启动子甲基化，占61.76%，见图2。
2.4NSCLC细胞株hMLH1甲基化状态及5AzaCdR的干预作用
3例细胞株甲基化的状态为：A549和SPCA1为甲基化而SH77为去甲基化状态；A549、SPCA1 mRNA均不转录，经5AzaCdR处理后恢复转录，而SH77经5AzaCdR处理前后均存在转录水平无变化，见图3。
3讨论
目前认为基因启动子CpG岛甲基化是导致基因特别是抑癌基因失活的重要原因，启动子甲基化在NSCLC发生发展中的重要作用正受到越来越多的重视。
hMLH1在癌组织中的甲基化率明显高于癌旁组织，说明hMLH1启动子甲基化具有肿瘤特异性。DNA的甲基化在哺乳动物体细胞发育过程中也发挥正常的生理调节作用，研究表明某些基因的甲基化水平随着年龄增长而升高 ［1］，本研究也发现hMLH1启动子甲基化发生率在≥65岁年龄组高于＜65岁组。
烟草与肺癌尤其是鳞癌发生的关系密切，烟草中的致癌物质是否直接导致基因发生甲基化目前尚无定论，但动物实验表明烟草中的致癌物可以诱导小鼠体内某些基因如DAPK、RASSF1a等发生甲基化 ［2］。本研究证实在NSCLC中hMLH1基因的甲基化率与吸烟指数密切相关，提示烟草具有潜在的诱导hMLH1发生甲基化，与 Hsu等［3］的研究结论一致。
临床TNM分期决定了NSCLC的预后和肺癌的进展状况，基因的甲基化是否与TNM分期有关？本研究证实hMLH1的甲基化水平随着临床TNM分期的进展而逐渐增加，提示hMLH1的甲基化与NSCLC的局部侵犯、淋巴转移及远处转移密切相关，说明基因的甲基化是一个肺癌发生的早期分子信号，并与肺癌的局部侵袭、淋巴转移及远处转移有关，国外学者的研究也表明hMLH1的甲基化可能提示肺癌患者的预后较差［3］。
导致基因转录失活的机制包括点突变、纯合删除以及胞嘧啶核苷酸的异常甲基化，而启动子甲基化在基因转录中的调节作用受到越来越多的重视。目前认为基因启动子区域发生甲基化后，DNA的双螺旋结构变得更加紧密而影响解链过程，从而抑制基因的转录过程［4］。Wang等［5］人发现NSCLC甲基化率达55.8%，并与该基因mRNA的转录水平密切相关，这与本研究结论一致，由此推断启动子甲基化是调节hMLH1转录的重要机制。
5AzaCdR是一潜在的去甲基化剂并且具有抑制细胞分化的作用，许多学者都证实5AzaCdR在体外具有逆转基因的甲基化而恢复mRNA的转录水平［6］。本研究证实，5AzaCdR具有逆转hMLH甲基化恢复其转录活性的作用，提示5AzaCdR可能成为潜在的NSCLC基因治疗的试剂。
总之,hMLH1启动子甲基化与NSCLC的病理生理密切相关，并且启动子甲基化是调节其转录的重要机制，在细胞株水平5AzaCdR可以逆转hMLH1的转录活性，本研究为进一步阐明NSCLC的发生机制及NSCLC的基因诊断和治疗奠定理论基础。
【参考文献】
［1］ Waki T,Tamura G,Sato M,et al.Agerelated methylation of tumor suppressor and tumorrelated genes:an analysis of autopsy samples\[J\].Oncogene,2003,22(26):41284133.
\[2\]Pulling LC,Vuillemenot BR,Hutt JA,et al.Aberrant promoter hypermethylation of the deathassociated protein kinase gene is early and frequent in murine lung tumors induced by cigarette smoke and tobacco carcinogens\[J\].Cancer Res,2004,64(11):38443848.
\[3\]Hsu HS,Wen CK,Tang YA,et al.Promoter hypermethylation is the predominant mechanism in hMLH1 and hMSH2 deregulation and is a poor prognostic factor in nonsmoking lung cancer\[J\].Clin Cancer Res,2005,11(15):54105416.
\[4\]Burgers WA,Fuks F,Kouzarides T.DNA methytransfase get connected to chromatin\[J\].Trends Genet,2002,18(6):275277.
\[5\]Wang YC,Lu YP,Tseng RC,et al.Inactivation of hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary nonsmall cell lung tumors and matched sputum samples\[J\].Clin Invest,2003,111(6):887895.
\[6\]Bovenzi V,Momparler RL.Antineoplastic action of 5aza2′deoxycytidine and histone deacetylase inhibitor and their effect on the expression of retinoic acid receptor beta and estrogen receptor alpha genes in breast carcinoma cells\[J\].Cancer Chemother Pharmacol,2001,8(1):7176.
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