survivin及 bcl2基因表达在胃癌细胞株MGC803顺铂耐药中的作用(1)-找论文网

【摘要】 目的探讨胃癌细胞株MGC803对顺铂（CDDP）耐药产生的有关机制。方法观察不同浓度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)对MGC803细胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl2 mRNA表达的影响，用MTT法检测细胞生长抑制率；荧光染色检测细胞凋亡率；流式细胞仪测定细胞周期的变化；RTPCR检测survivin、bcl2 mRNA的表达。结果 10mg/L的CDDP对MGC803细胞有较强的抑制增殖、促进凋亡作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干预24h后，其抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用逐渐消失；CDDP作用于细胞48h后，细胞S期增加，G2/M期下降；MGC803细胞在1.0mg/L的CDDP作用下，survivin mRNA表达自24h后逐渐增高，bcl2 mRNA表达逐渐下降(P＜0.05)。结论 CDDP可干扰MGC803细胞周期，但该细胞对低浓度CDDP易于产生耐药，survivin mRNA表达增高可能是MGC803细胞对CDDP产生耐药原因之一。

【关键词】 胃癌细胞株顺铂耐药细胞凋亡 survivin bcl2

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率居各类恶性肿瘤之首，化疗作为胃癌的重要治疗手段之一，其疗效仍不令人满意，原因主要与癌细胞耐药有关。为此，本实验参照文献[1], 将胃癌常用化疗药物顺铂（Cisplatin,CDDP）设为三个不同作用浓度，通过检测MGC803细胞在顺铂作用过程中细胞周期，细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因survivin、bcl2 mRNA的表达变化，探讨胃癌细胞对细胞毒性药物顺铂耐药的产生及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

RPMI 1640培养液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青公司），四噻唑蓝（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl2引物[2](上海生工合成)；βactin（上海瑞科公司）；二步法RTPCR试剂：Taq酶、oligodT、dNTP、DEPC（Sangon公司），MNLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山东齐鲁制药厂，生理盐水溶解，培养液稀释）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代

人胃低分化腺癌细胞株MGC803购自湘雅医学院细胞中心。细胞于含青霉素100U/L，链霉素100mg/L，10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中,置37℃，5％ CO2培养箱内培养。

1.2.2 MTT比色法测定药物对细胞增殖的影响

以5×103/孔接种MGC803细胞于96孔培养板，设3个复孔，实验组加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L，对照组加生理盐水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，继续培养4h，弃上清，加150μl的DMSO，酶联免疫检测分析仪测定570nm处的吸光值A570nm，并计算该浓度下的抑制率＝[(对照组A570nm -试验组A570nm)／对照组A570nm]×100％。

1.2.3 荧光显微镜检测各组药物对细胞凋亡的作用

MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，设3个复孔,收集细胞离心，弃上清，PBS洗3次，制成细胞悬液，加入终浓度均为100μg/ml的AO、EB，混匀，于显微镜下计数至少200个细胞的凋亡比率。早期凋亡细胞核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状；坏死细胞核染色质着桔红色，呈正常细胞结构；活细胞核染色质着绿色，呈正常细胞结构[3]。

1.2.4 流式细胞仪检测各组药物对细胞周期的影响

MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，对照组加生理盐水，共同作用48h,常规消化细胞，离心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每个样品含细胞数至少1×106个，－20℃固定送检流式细胞。

1.2.5 RTPCR法检测CDDP干预前后survivin、bcl2 mRNA表达变化

总RNA的制备：MGC803细胞接种于6孔板，试验组加CDDP处理，使终浓度达1.0mg/L，对照组加生理盐水，设3个复孔，采用Trizol法提取药物干预前及干预12、24、48、72h细胞总RNA。

RNA逆转录：按MMLV说明书进行，cDNA置－20℃保存备用。

PCR扩增：反应体系包括10×Taq Buffer5μl，25mM/L MgCl23μl，10mM DNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物: 5'CAG ATT TGA ATC GCG GGA CCC 3', 下游引物: 5'CCA AGT CTG GCT CGT TCT CAG 3'; bcl2上游引物: 5'GTG GAG GAG CTC TTC AGG GA 3', 下游引物: 5' AGG CAC CCA GGG TGA TGC AA 3')、βactin上、下游引物各2μl，cDNA模板4μl，2.5U/μl Taq酶1μl，补充DEPC水至50μl。置PCR扩增仪上扩增，95℃预变性5min，变性、退火、延伸分别为94℃30s、X℃（survivin为61℃、bcl2为59℃）1min 、72℃1min，30个循环后72℃终末延伸10min。PCR产物用含0.5mg/Lde1的EB琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析结果，计算目的基因与相应βactin的比值。

1.3 统计学处理

定量及半定量资料,用均数±标准差表示， SKNq检验进行统计分析。

2 结果

2.1 MTT比色法测定各浓度CDDP对胃癌细胞增殖的影响

各复孔平均吸光值结果发现,高浓度CDDP（10.0mg/L）组随时间的延长，细胞增殖降低明显(P＜0.05)；而低浓度(0.1mg/L、1.0mg/L)CDDP组在作用24h后不再明显下降，说明MGC803细胞对低浓度CDDP抑制增殖作用易产生耐受，见表1。表1 CDDP 对MGC803细胞增殖的影响实验组与CDDP处理前比较，*P<0.05,**P<0.012.2荧光染色检测各组CDDP对胃癌细胞凋亡的影响

荧光染色计数凋亡细胞发现，高浓度的CDDP（10.0mg/L）作用后，细胞凋亡率随作用时间的延长而增加(P＜0.05),见图1,而低浓度的CDDP（0.1mg/L,1.0mg/L）作用于MGC803细胞24h后，细胞凋亡率几乎不再发生改变，表2。表2CDDP对 MGC803细胞凋亡的影响表达变化（bcl2 mRNA 304bp,βactin 500bp）

2.3流式细胞检测各组CDDP对胃癌细胞周期的影响

MGC803细胞经不同浓度的CDDP作用48h后，细胞S期比率逐渐增加，G2/M期下降。CDDP对细胞周期的影响具有明显的量效依赖关系,见表3。表3 CDDP对 MGC803 细胞周期的影响

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