血管生成抑制因子arresten的真核表达体系的建立(1)-找论文网

【摘要】 目的构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2arresten 将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin 筛选获得阳性细胞克隆，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测arresten mRNA表达，免疫蛋白印迹技术(Westernblot)测arresten蛋白的表达。结果经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞，RTPCR、Westernblot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达。结论获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础。

【关键词】 arresten 真核表达 CHO

arresten是Colorado等[1]发现的一种强效的血管生成抑制因子，它属于Ⅳ型胶原α1链的羧基末端NC1结构域多肽片段，其分子量为26ku，它能够通过抑制血管生成进而抑制裸鼠移植瘤的生长。但有关arresten因子的分子结构特点及其抑制肿瘤血管生成的具体途径和作用机制目前知之甚少。我们采用脂质体转染的方法将arresten基因的表达质粒导入体外培养的中国仓鼠卵巢CHO细胞株中，经过筛选，并鉴定其表达,在国内首先获得了arresten真核表达细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用途径和具体机制奠定了良好的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞真核表达质粒pSecTag2 arresten本课题组构建（另文发表），中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)由华中科技大学同济医学院中心实验室提供。

1.1.2 主要试剂 F12培养基、新生牛血清、Trizol为Gibco产品，一步法RTPCR试剂盒购自大连宝生物有限公司，引物由上海生工科技公司合成，PCR marker为天为时代产品。脂质体Lipofectamine 2000、抗生素Zeocin 购自Invitrogen公司，抗人arresten抗体及二抗 HRP标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表达质粒pSecTag2arresten转染CHO细胞用阳离子脂质体Lipofectamine 2000 介导转染CHO细胞。根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组：pSecTag2arresten转染组；转染空载体pSecTag2的阴性对照组;未转染的CHO细胞空白对照组，转染方法按照Lipofectamine 2000说明书进行操作。简单过程如下：转染前2 d以胰酶消化CHO细胞，接种24孔板，每孔计数细胞在(1～3)×105个，以含血清无抗生素的F12培养基培养，细胞为90%的面积时用于转染，以1μg pSecTag2arresten溶于50μl培养基，2μl Lipofectamine 2000溶于50μl培养基，孵育5 min后混合20 min，缓慢滴入含有500μl OPTIDMEM无血清培养基的CHO细胞中，6h后将培养液换为含血清的F12培养基培养。

1.2.2 阳性克隆的筛选转染后的第24h，将培养板中的细胞按1∶10比例分散培养，转染后的第48h开始加抗生素Zeocin进行筛选，筛选浓度为130μg/ml，出现阳性克隆后，100μg/ml维持筛选约15d。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测转染的arresten基因的mRNA表达根据已知的arresten基因序列，使用Primer5引物设计软件设计引物,引物由上海生工工程有限公司成。上游引物序列P1为：GTCAGGATCCTCTGTTGATCACGGCTTC，下游引物序列P2为GGGCAAGCTTTGTTCTTCTCATACAGAC；内参照物βactin上游引物序列βactin1为CTCCGCAGGGTGTGATGGTG；下游引物序列βactin2为AGAAGGGCGTGCTGAGAAGTTGA。arresten、Bactin的扩增片断分别为711bp和307bp。采用一步法行RTPCR，反应体系：Rnase Free H2O 19μl,5χ Reaction Buffer 10μl,2.5mM dNTPs 6μl,25mM Mn(Oac)2μl,P1 2μl,P2 2μl,βactin1 2μl,βactin2 2μl,10u/μl Rnase 抑制剂2μl,2.5 u/μl rTth DNA polymerase 2μl, 总RNA 2μl。反应条件：60℃,30min；94℃,2min；94℃,10min，60℃,1.5min,共40次循环；最后，60℃延伸7min。产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 免疫印迹技术（Westernblot）检测arresten蛋白的表达表达产物的SDSPAGE电泳和 Western blotting分析均按常规方法进行。简单过程如下：用去污剂裂解细胞， SDSPAGE蛋白电泳，电转PVDF膜，加30g/L脱脂奶粉封闭，PBST洗膜，加兔抗人1∶1 000抗arresten 一抗，室温孵育1h，PBST洗膜；加羊抗兔1∶10000 HRP标记二抗，室温孵育1h，PBST洗膜，混合化学发光试剂1和试剂2加至膜上1min，最后X片显影。

2 实验结果

2.1 稳定转染的阳性克隆细胞倒置显微镜下观察发现，阳性克隆细胞细胞形态学与未转染细胞相比无明显变化。

共2页: 1 [2] 下一页

survivin及 bcl2基因表达在胃癌细胞株MGC803顺铂耐药中

极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用