2.2 arresten基因的RTPCR鉴定 电泳结果显示，转染阳性质粒pSecTag2arresten组出现长度约的711bp特异性条带，而未转染组及转染pSecTag2组无相应条带 ，该实验结果证实外源性arresten基因成功转染入CHO细胞，见图1。
M：marker；1:转染pSecTag2arresten组;
2:转染pSecTag2组;3:未转染的空白对照组
图1 转染基因的RTPCR鉴定
2.3 真核arresten蛋白的表达 Westernblot分析表明，转染阳性质粒pSecTag2arresten组有高表达的arresten蛋白条带，而转染空质粒pSecTag2和未转染的对照组无arresten蛋白表达，该实验结果提示arresten基因已经在CHO细胞获得了稳定表达，见图2。
1:转染pSecTag2arresten组;2:转染pSecTag2组;
3:未转染的空白对照组
图2 arresten蛋白在CHO细胞中的表达
3 讨论
1971年Folkman提出了“肿瘤的生长必须依赖血管”的著名论点，并逐渐被人们所接受。从那时起，抑制血管生成是抗肿瘤治疗研究的热点。近年来，国内外医学专家研究发现，肿瘤血管是肿瘤细胞生长和转移的形态学基础，肿瘤血管除向肿瘤细胞提供营养外，还不断地向人体其他部位输送肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的生长和转移。因此，抑制血管生成是有效的抑制肿瘤细胞生长也转移的的手段。目前，血管生成抑制剂的研究主要有如下4种策略：(1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力；(2)直接抑制内皮细胞的功能；(3)阻断血管生成因子的合成和释放，拮抗其作用；(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用[2]。arresten是Colorado等在2000年发现的血管生成抑制因子，该因子能够抑制裸鼠移植瘤的生长。arresten与内皮抑素同为来自胶原蛋白的血管生成抑制因子，但与内皮抑素endostatin一样无任何毒副作用，而且它还有arresten自身的优点，它是一种稳定的蛋白质，能够有效的保持其活性，而内皮抑素因其蛋白质的不稳定可能限制其使用，更重要的是，arresten抑制裸鼠移植瘤生长的效果均强于内皮抑素[1]。然而arresten确切的抑制血管生成的具体途径及其相关机制目前并不清楚，而获得该因子是深入进行arresten相关研究的前提。
我们在先前研究已经在国内首先获得原核表达的arresten蛋白[3]，原核表达虽产量高，但产物的复性差、活性低，我们用原核表达的arresten进行的相关实验也未得到理想的结果。而CHO细胞是目前较常用的真核表达体系，它可较长时间地表达所携带的基因而不衰减, 并能稳定地大量表达，其表达产生的蛋白质具有糖基化、磷酸化等修饰，具有良好的生物学活性，因此被广泛用于蛋白表达和疫苗生产。我们通过脂质体转染方法行将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得了阳性克隆细胞，随后进行的RTPCR证实我们成功在CHO细胞中导入arresten基因，并通过Westernblot检测到arresten蛋白的表达条带，该结果表明，即我们已成功将arresten成功整合到CHO细胞染色体中，并正常转录和特异表达。这表明我们成功建立了人arresten真核表达细胞克隆体系。在此基础之上，我们可以进行蛋白纯化并获得arresten蛋白，为深入研究arresten的作用机制提供了基础。
综上所述，本实验在国内首先成功获得了稳定转染arresten基因的真核CHO细胞克隆，为深入研究arresten因子抑制血管生成的作用途径及其相关机制奠定了基础。
【参考文献】
［1］ Colorado PC, Torre A, Kamphaus G,et al. antiangiogenic cues from vascular basement membrane collagen\[J\]. Cancer Res, 2000, 60（11）:25202526.
［2］ Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis\[J\]. Cell，1996,86（7）:353364.
［3］ 关启昌,郑幼伟,宋自芳,等.血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达\[J\].中国生物工程杂志,2002,22（4）：8992.
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