【摘要】 目的 观察紫杉醇、吉西他滨两药联合对鼻咽癌细胞系HNE2的放射增敏作用，并探讨其可能机制。方法 将HNE2细胞分为单纯照射组、吉西他滨（GE）＋照射组、紫杉醇（PA）＋照射组及GE+PA+照射组，用克隆形成实验计算两药物单用及合用的放射增敏比，流式细胞仪法分别检测、比较各组的细胞凋亡率及细胞周期变化。Western blot法测定各组细胞凋亡相关基因bcl2、bax的表达水平。结果 吉西他滨、紫杉醇及两药联合使用的放射增敏比分别为1.06、1.13和1.34。流式细胞仪检测显示吉西他滨联合射线主要诱导S期阻滞（96.03％），诱导凋亡率为31.62％；紫杉醇联合射线引起的阻滞以G2＋M期为主（75.71%），诱导细胞凋亡率为44.56%；两药合用并联合照射后G2＋M 期比例（65.98%）有所下降，同时S期比例（33.33%）有所上升（与PA+放射组比较），细胞凋亡率达到73.28%。在四组中bcl2的表达呈逐步下降趋势，而bax的表达则呈逐步上升趋势。结论 吉西他滨、紫杉醇单用及两药联合对鼻咽癌细胞系HNE2均有放射增敏作用，且两者协同增敏作用显著高于单独增敏作用，显示了两药联合应用有助于提高鼻咽癌的放射敏感性。两者协同放射增敏作用的机制可能与凋亡有关。
【关键词】 紫杉醇 吉西他滨 鼻咽癌 放射增敏
0 引言
放射治疗一直是治疗鼻咽癌的首选方法。近年来已有作者报道分别将紫杉醇[1]（Paclitaxel，PA）和吉西他滨[2]（Gemcitabine，GE）联合放射治疗鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但两药联合使用增加放射敏感性的报道尚属少见。本试验选用鼻咽癌细胞株HNE2作为研究对象，研究了紫杉醇和(或)吉西他滨联合放射对HNE2细胞增殖、凋亡的影响，以探讨PA和GE协同作用对HNE2细胞的放射敏感性的影响及其可能机制。
1 材料和方法
1.1 细胞株、药物和试剂 人鼻咽癌HNE2细胞株购自湖南湘雅医学院肿瘤研究所。紫杉醇和吉西他滨分别为美国百时美施贵宝公司及礼来公司产品。兔抗人多克隆第一抗体及生物素标记的第二抗体由北京中山生物技术有限公司提供，系美国Santa Cruz产品。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。
1.2 细胞及培养条件 人鼻咽癌HNE2细胞株培养于含有10%胎牛血清的PRMI1640培养基中，添加100IU/ml青霉素及链霉素，37℃、100%湿度、5%CO2条件下常规培养。
1.3 MTT法测定药物 IC50及IC10值HNE2细胞按103/孔接种于96孔培养板，待16～18h后贴壁生长至对数生长期时，将PA用培养基依次稀释为500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml，分别按100μl/孔加入96孔板，每一浓度设3复孔，并设正常对照孔及空白调零孔。同法将HNE2细胞按5×103/孔接种于96孔培养板，GE依次稀释为2000μg/ml、200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml加入96孔板。置37℃培养箱孵育24h后，弃去药物及陈旧培养基，每孔加新鲜配制的MTT（5mg/ml）20μl再次孵育4h，弃去MTT液，每孔加DMSO150μl，振荡15min，酶联免疫检测仪于490nm波长测定吸光度D。重复3遍。肿瘤细胞抑制率＝（1实验组吸光度/对照组吸光度）×100%
1.4 克隆形成实验测定药物放射增敏性 将正常细胞、GE作用24h后细胞、PA作用24h后细胞及两药联合作用（浓度同上）24h后细胞组常规消化后分别按不同照射剂量以不同密度接种于60mm培养皿，每组细胞给予6MV X射线单次照射0、2、4、6、8Gy，恒温箱中培养12d。12d后取出培养皿，弃去培养基，PBS清洗2遍，甲醇固定15min，去除固定液，姬姆萨染色30min，对含50个细胞以上的克隆进行计数。多靶单击模型拟合细胞存活曲线并计算增敏比。
1.5 流式细胞分析 将培养于50ml培养瓶中呈对数生长的HNE2细胞随机分为：（1）单纯照射组、（2）GE＋放射组、（3）PA＋放射组、（4）两药联合＋放射组。单纯照射组仅给予6Gy照射，其余三组分别给予GE（0.2μg/ml）、PA（0.1μg/ml）及GE和PA的混合液作用24h后弃药并照射6Gy。以上四组共同孵育24h，常规消化后800r/mim离心5min，弃上清，PBS清洗2遍，80%乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇，PBS清洗2遍，用RNase（终浓度0.02mg/ml）、PI（终浓度0.1mg/ml）及0.3%的TritonX100混合配制成的PI染液避光染色30min，流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况。
1.6 Western Blot法测定bcl2、bax的表达 分组及每组处理方法同1.5，将四组细胞常规消化后置EP管800r/min离心5min，弃上清，PBS清洗2遍，每管加新鲜配制的裂解液100μl，4℃裂解30min，随后 4℃ 12 000r/min离心15min，吸上清，每个样本均分装成5μl及60μl两管，－20℃保存。将5μl/管蛋白加上样buffer沸水煮5min，BCA法测样本蛋白浓度。用15%的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本蛋白，电转移至硝酸纤维素滤膜上，与兔抗人bcl－2及bax多克隆抗体4℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1h，ECL显色，X射线片显影。实验重复3遍。
1.7 统计学处理 所用数据均以均数±标准差表示，结果用SPSS13.0统计软件进行t检验。
2 结果
2.1 GE及PA的IC50和IC10值 MTT实验表明不同浓度梯度的PA及GE作用细胞24h后，细胞抑制率随药物浓度的增加而增加，结果见表1。应用IC50计算软件求出GE的IC50及IC10分别为173.2μg/ml和0.210μg/ml。PA的IC50及IC10分别为2.73μg/ml和0.13μg/ml。以下的实验均选用两种药物的大致IC10浓度0.2μg/ml（GE）和0.1μg/ml（PA）。表1 GE及PA对HNE2细胞的生长抑制作用
2.2 GE、PA及GE+PA对细胞放射敏感性的影响 将正常细胞、GE、PA作用后细胞及两者联合作用后细胞分别给予0、2、4、6、8Gy射线照射后多靶单击模型拟所得结果如图1。单纯对照组细胞存活曲线的D0=3.17，Dq＝1.73；GE组的D0=2.99，Dq＝1.52；PA组的D0=2.8，Dq＝1.44；联合用药组的存活曲线与前三组相比明显下移，肩峰变窄，D0=2.37，Dq＝1.07。吉西他滨的增敏比（单纯照射组D0与吉西他滨组D0之比值，以下类推）为1.06，紫杉醇的增敏比为1.13，而两药联合后的增敏比为1.34，明显高于两药分别使用时的增敏比(P<0.05)。
2.3 不同处理对细胞周期及细胞凋亡的影响 图2显示四组细胞经不同处理后的细胞周期分布。单纯照射6Gy引起的阻滞以G2＋M期（36.92±0.76）%为主；紫杉醇联合照射可进一步诱导G2＋M期阻滞（75.71±0.51）%；吉西他滨联合射线引起的阻滞以S期（96.03±0.25）%为主；两药联用并联合放射后 G2＋M 期比例（65.98±0.59）%有所下降，同时S期比例（33.33±0.73）%有所上升（与PA+放射组比较）。图3显示四组细胞经不同处理后均出现不同程度的凋亡，其中以PA+GE+放射组最为明显（73.28±0.37）%，显著高于其中任一单药联合放射后引起的细胞凋亡率（31.62±0.64）%或（44.56±0.62）%,P<0.05。
2.4 对bcl－2及bax表达的影响 Western Blot检测得到bax在GE+PA+放射组、PA+放射组、GE+放射组及单纯照射组各组中的表达呈逐步下降趋势，而bcl－2在上述各组中的表达呈逐步上升趋势，见图4、5。
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