作者：易海波 石松生 杨卫忠 陈春美
【摘要】 目的 研究Notch1在人脑胶质瘤中的表达，并对其表达与胶质瘤病理级别的关系进行研究，探讨Notch1对人脑胶质瘤发生、发展所起的作用，从而为胶质瘤的治疗提供一定的理论依据。方法 应用半定量RTPCR方法检测70例人脑胶质瘤标本和12例正常脑组织中的Notch1 mRNA的表达。结果 Notch1 mRNA在人脑胶质瘤和正常脑组织中均可表达，且在人脑胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织（P<0.01）；人脑胶质瘤Ⅰ～ Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级组中Notch1 mRNA表达均显著高于正常脑组织（P<0.01），并且Notch1 mRNA在人脑胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级组中的表达显著高于Ⅰ～ Ⅱ级组（P<0.01）。结论 Notch1 mRNA在人脑胶质瘤和正常脑组织中均表达，且在人脑胶质瘤中呈显著高表达，可能与人脑胶质瘤的发生、发展有关；Notch1的表达与人脑胶质瘤的病理分级相关。
【关键词】 Notch1 胶质瘤 RTPCR
The Expression and Significance of Notch1 Gene in Human Gliomas
Key words：Notch1;Glioma;RTPCR
Notch信号通路是一个既简单又复杂的信号通路，且在多个物种中表达。Notch信号对于细胞的生长发育具有广泛的多样化的影响，包括干细胞的维持；细胞分化、增殖和凋亡的决定。1991年，Notch1在人类T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定出来，首次提示了Notch信号通路与肿瘤相关[1]。许多体外及动物实验中已证实，活化的Notch可使正常细胞向恶性转化。已有越来越多的证据表明异常的Notch信号与一些人类肿瘤的发生发展相关。
本实验从基因水平，检测Notch1在各级别人脑胶质瘤和正常脑组织的表达情况。分析其与胶质瘤病理级别的相关性，探讨Notch1在人脑胶质瘤中的作用机制。
1资料与方法
1.1资料来源
收集福建医科大学附属协和医院神经外科2004年1月～2005年9月手术切除的人脑胶质瘤新鲜标本70例，男39例，女31例，年龄2～92岁，平均40.3岁。按2000年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ～Ⅱ级（低度恶性胶质瘤）34例，包括星形细胞瘤Ⅰ、Ⅱ级25例、室管膜下瘤1例、少突胶质细胞瘤4例、少突－星形细胞瘤4例；Ⅲ～Ⅳ级（高度恶性胶质瘤）36例，包括间变性星形细胞瘤15例、间变性少突胶质细胞瘤6例、间变性少突－星形细胞瘤6例、间变性少突胶质细胞瘤伴部分胶质母细胞瘤变2例、胶质母细胞瘤7例。通过内减压手术获得新鲜正常脑组织标本12例作为对照。
1.2 主要试剂
Trizol（Invitrogen公司），二步法RTPCR试剂盒（Promega公司），Taq DNA聚合酶（上海普洛麦格公司）。
Notch1引物序列为利用Primier 5.0软件自行设计。
Notch1：上游引物序列：5’CGT GCA GAG TGA GAC CGT GGA3’ 下游引物序列：5’TGC GGT CTG TCT GGT TGT GCA3’
扩增片断长度为599bp。
βactin：上游引物序列：5’CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA3’下游引物序列：5’GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG 3’
扩增片断长度为234bp。
1.3 方法
1.3.1采用TRIzol法提取组织总RNA取少量组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳测试RNA完整。
1.3.2按RTPCR kit（二步法）说明书进行cDNA的合成取1μg RNA至于PCR管，70℃孵育10 min后，稍离心放置冰上。加入MgCl2 4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 2μl，RNasin 0.5μl，Oligo(dT)15引物 1μl，AMV反转录酶0.75μl，加ddH2O补足至20μl，将反应体系于42℃ 60min，95 ℃ 5min，4℃ 5min。
1.3.3PCR反应体系cDNA 2μl，dNTP 0.9μl，MgCl2 3.75μl，10×PCR buffer 4.9μl，上下游引物（20pmol/μl）各1.25μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH20补至50μl，混匀，离心。反应条件：94℃预变性5min;变性94℃ 30s，退火58℃ 40s，延伸72℃ 40s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
1.3.4取 PCR产物5μl，1.2%琼脂糖凝胶电泳（电压100V，时间25min）。将电泳凝胶置于凝胶图像分析系统（Gel Doc 2 000）半定量分析。
1.4 统计学分析
凝胶图像分析系统进行灰度分析，结果以±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。
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