作者：吴永忠,任庆兰,李少林
【摘要】 目的 探讨cerbB2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。 方法 实验分空白对照组、正常对照组、cerbB2正义对照组及cerbB2反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。 结果 反义治疗组与正义对照组比较：转染72h OD值分别为0.201与1.298（P＜0.01）；克隆形成率分别为26.5%与76.5%（P＜0.05）；凋亡率分别为21.3%与7.5%（P＜0.05），同时明显地下调cerbB2蛋白质的表达水平（P＜0.05）。结论 在卵巢癌的基因治疗中，cerbB2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。
【关键词】 SKOV3细胞 反义寡核苷酸 卵巢癌 cerbB2基因
Inhibitory Effects of cerbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides Transfection on the Human Ovarian Carcinoma SKOV3 Cell Lines
. Key words：SKOV3 cell lines;Antisense oligodeoxynucleotides;Ovarian carcinoma;cerbB2 gene
卵巢癌已成为女性生殖系统恶性肿瘤死亡的首位原因。美国每年新发病率达到23 000例左右［1］。其总的5年生存率不到30%[2]。近30年来，卵巢癌发病率上升了3倍，治疗手段虽有改进，疗效却仍然不令人满意。有作者指出生物治疗在卵巢癌的治疗中将起关键性的作用[3]，在分子水平上控制卵巢癌的发生发展可能成为最大的希望。本课题采用cerbB2反义寡核苷酸联合转染的方法，通过一系列实验，在细胞水平观察它们对人卵巢癌SKOV3细胞株增殖的抑制作用及其初步分子机制。
1材料与方法
1.1材料
SKOV3细胞株购自重庆医科大学基础医学院肿瘤研究室。阳离子脂质体（lipofectin）购自美国sigma公司。cerbB2正义脱氧寡核苷酸（SODN）序列为：5′GGTTCACACGTGGCC3′，cerbB2 ASODN序列为5′CCAAGTGTGCACCGG3′[4]。所有SODN与ASODN均由上海生物工业公司合成并全部经硫代磷酸化修饰。RPMI1640培养基、小牛血清、各种抗体等试剂均购自美国hyclone公司。转染液为自制的无血清无抗生素RPMI1640培养液。实验所用仪器均由重庆医科大学分子生物学实验室提供。
1.2方法
1.2.1细胞培养SKOV3细胞在37℃、5%CO2条件下、含10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。传代培养时，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化2～5min后，用RPMI1640培养液终止消化，在低速离心机上1 500r/min离心5min，弃上清，再用PBS液重悬细胞，再离心5min。利用ELX800微孔板读数仪调整细胞浓度后，接种到新的培养瓶。
1.2.2实验分组 共设立4组：0组:空白对照组，仅予以转染液处理;I组:正常对照组，阳离子脂质体lipofectin + 转染液;Ⅱ组:正义治疗组，cerbB2 SODN + lipofectin + 转染液;Ⅲ组:反义治疗组，cerbB2 ASODN+ lipofectin + 转染液。
1.2.3脂质体转染方法按照产品说明书进行，脂质体与寡核苷酸的比例为1∶4。
1.2.4MTT试验脂质体转染20h后再分别培养24、48、72h。培养48h时换液一次。到相应终止时间，弃原培养液，每孔加入转染液90μl，再加入MTT（5mg/ml）10μl，放入CO2孵箱中孵育4h。弃上清，每孔加入DMSO 100μl，震荡10min。酶联免疫检测仪570nm波长比色。
1.2.5平板集落形成试验脂质体转染20h后，吸去上清液，用0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为103/ml。取9cm培养皿24个，每组3个平行皿，分别预置10ml普通培养液，做好分组标志。每皿接种单细胞悬液各200μl，即细胞数为200个/皿，然后十字方向轻巧晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿移入CO2孵箱中，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，静止培养2.5周。肉眼下计数细胞形成的集落数，对难以判断者，在显微镜下计数＞50个细胞的集落数。
集落形成率（%）＝计数细胞集落数/200×100%。
1.2.6AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡脂质体转染20h后，弃上清，加入RPMI1640培养液再培养72h。培养48h时换培养液一次。新鲜配制AO/EB混合液，AO(100μg/ml)与EB(100μg/ml)按1∶1混合即可。培养72h终止实验，用无菌小镊子取出盖玻片，置于载玻片上，加AO/EB混合液一滴于盖玻片上，荧光显微镜下计数。
凋亡率（%）=(VA＋NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。
1.2.7流式细胞仪检测cerbB2蛋白（p185）
脂质体转染20h后，弃上清，加入RPMI1640培养液再培养72h。吸去上清液，常规消化细胞，1 500r/min离心5min，弃上清。用4℃ PBS重悬细胞后，移至EP管中，再次1 500r/min离心5min。重复上一步一次。各加入1%福尔马林液固定2h， 1 500r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞3次。各加入0.5%皂角素1ml，室温静置15min，1 500r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞3次。各加入1∶10鼠抗人单克隆抗体IgG 50μl，置室温1h，PBS洗涤细胞3次。各加入1∶5兔抗鼠FITC标记的抗体IgG 10μl，置室温1h。流式细胞仪检测cerbB2蛋白的荧光强度。
1.3统计分析
用SPSS 10.0统计软件处理。检测数据以±s表示，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有极显著性。
神经酰胺的代谢在肿瘤化疗和耐药中的作用
异基因造血干细胞移植后继发第二肿瘤的研究进展