作者：黄浩 凃欣，余南才，吴文莉，刘倩，马威，郝建军，易艳东
【摘要】 目的 构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在 Hela细胞表达，同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法 将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14，并通过酶切和测序等方法进行鉴定，将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞，运用Western blot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长，阻滞细胞G0/G1—S期，PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现，实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。
【关键词】 子宫颈癌 增殖细胞核抗原 小发夹结构RNA 子宫颈癌细胞
Constructed Eukaryotic Expression Plasmid of Small Hairpin RNA （shRNA） of PCNA and Investigated the Inhibitory Effect on Hela Cell
Key words：Uterine cervix carcinoma；Proliferating cell nuclear antigen；Small hairpin RNA；Hela cell
肿瘤的发生与基因突变及细胞增殖有关。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是在细胞周期S期广泛表达的一种核蛋白,是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36KD多肽, 其功能是DNA聚合酶δ的重要辅助蛋白,在DNA合成中是绝对必需的,在细胞增殖过程中有重要意义, PCNA阳性表达说明该细胞正处于增殖状态。因此, PCNA作为一项评估细胞增殖状态的指标不仅用于病理学研究,而且近年来在肿瘤研究中的应用日渐增多［1］。
RNA干预（RNA interference,RNAi）本质是一种双链RNA（doublestranded RNA,dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默［2］ (posttranscriptional gene silencing,PTGS)。shRNA是45-50mer的小发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA），通过将其转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制［3］。
图1 真核表达载体pGenesilPCNA14的构建
我们根据PCNA的cDNA的序列设计shRNA的引物，插入真核表达载体pGenesil1,构建正确的真核表达质粒，见图1，导入Hela细胞中并研究其产生siRNA对Hela细胞干预的影响。为RNAi干预技术对肿瘤的基因治疗提供了实验理论和基础。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
HeLa细胞引自武汉大学生命科学院,培养于含10％小牛血清的DMEM的培养液中，37℃ 5％的CO2条件下培养，0.3％的胰酶消化和传代。
1.2 shRNA设计和合成
根据PCNA基因序列(NM_182649)， shRNA设计规则及blast同源搜索选取、设计四对引物及一对对照引物,每一对引物上游含BamHⅠ切点之后GATCC的粘性末端，引物下游互补端含HindⅢ切点的互补的TTCGA粘性末端，武汉市晶赛生物技术有限公司合成。
1.3 PCNA的shRNA的真核表达载体的构建
将真核表达载体pGenesil1和经BamHⅠ，HindⅢ双酶切后与纯化的含相应粘性末端的PCNA基因的shRNA四对引物片段和一对对照引物片段,进行线性连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经小量提取质粒测序鉴定。构建的表达质粒称pGenesilPCNA1、pGenesilPCNA2、pGenesilPCNA3、pGenesilPCNA4、pGenesilPCNAHK。
1.4 阳离子聚合物（梭华－SofastTM/DNA试剂盒）介导的细胞转染
细胞培养至40%～60%汇合，配制不同浓度的pGenesilPCNA14（浓度 5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml）梭华－SofastTM/DNA复合物，进行转染，具体操作步骤见试剂盒说明书。
1.5 流式细胞仪(FCM)检测
收集1.0×106细胞,用70%冷乙醇固定,加rNaseA (终浓度50μg /ml),用37℃水浴1h,加碘化丙啶(PI,终浓度20μg/ml),暗处冰浴染色1h。用流式细胞仪检测细胞周期分布,用通过ModFitLT3.1软件分析。
1.6 Westernblot定量检测PCNA蛋白
转染细胞如1.4，收集转染及正常的细胞，裂解液裂解,取20μl裂解样品液,进行SDSPAGE蛋白电泳，表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，进行Westernblot反应，通过BandScan5.0软件对杂交图进行分析，以βactin做为定量Marker，20pmol为定量单位。
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