原发性肺癌中DMBT1基因的表达(1)-找论文网

作者：文海云，罗松古，李君，何建猷

【摘要】 　　目的探讨原发性肺癌组织中DMBT1基因表达水平与肺癌临床和病理特征的关系。方法以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测原发性肺癌中DMBT1基因的表达水平。结果 37例原发性肺癌中10例DMBT1表达正常(27.03%,10/37)，有27例DMBT1表达低下或完全无表达（72.97%,27/37）;DMBT1的表达与原发性肺癌的病理类型、TNM分期、吸烟史等均无明显相关(P＞0.05)，但与肺癌组织分化程度及有无淋巴结和(或)远处转移有相关性（P＜0.01）。结论 DMBT1基因的表达水平与肺癌的发生和肿瘤细胞分化程度及是否存在转移明显相关。

【关键词】 原发性肺癌　DMBT1基因表达　逆转录聚合酶链反应

　　The Expression of DMBT1 Gene in Primary Lung Cancer

Key words：Primary lung cancer; DMBT1 gene expression; RTPCR

　DMBT1为近年来新发现的一种可能抑癌基因[1] ，它的突变失活被认为与多种肿瘤的发生发展密切相关，国内外已对肺癌与DMBT1之间的关系做了一些研究，并认为DMBT1至少存在两方面的功能，一方面与免疫防御和免疫监督有关，另一方面与上皮细胞分化有关[2]，本文作者曾有文章报道原发性肺癌中DMBT1基因纯合性缺失的情况[3]，为进一步探讨DMBT1基因与原发性肺癌发生、发展和转移的关系，本研究应用逆转录聚合酶链反应（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction，RTPCR）的方法检测了37例原发性肺癌组织中DMBT1基因表达水平的情况，并分析其与原发性肺癌生物学行为的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本取自广东医学院附属医院、湛江市中心人民医院和广东省农垦中心医院心胸外科2002年10月～2003年6月住院患者手术切除的肺组织，并经病理学检查确诊。全部标本均在手术时收集，取材后在1.5h内放入－70℃冰箱保存待检。肿瘤组织均在原发灶中心取材，并且避开坏死组织；癌旁正常肺组织取自距离肿块5cm以上的肺组织，并经病理学检查未见癌细胞。其中原发性肺癌患者37例，肺良性疾病患者5例。原发性肺癌患者临床病理特点详见表1。这里吸烟史的定义是指一个人曾经每天吸烟至少一支，时间至少一年[4]。肺良性疾病中，男性4例，女性1例，其中肺结核3例，支气管扩张2例。表1 DMBT1表达水平与原发性肺癌患者

临床病理特征的关系

病例特点例数DMBT1表达失活正常P年龄－63±965±8＞0.05(t=0.385)性别1.000 女性1293 男性25187肿瘤大小(cm)－5.0±1.45.1±1.8＞0.05(t=0.269)肿瘤分类0.460 中心型20164 周围型17116病理类型1.000 非小细胞肺癌

1.1.2 主要试剂异丙醇、氯仿和乙醇等均为国产分析纯，Trizol reagent购自 GIBICO公司，逆转录试剂盒购自广州基因工程公司，实验试剂均用无菌去离子三蒸水配制。

1.1.3 引物引物设计参照文献，均由上海生物工程公司合成，包括5’末端、3’末端和βactin引物，见表2。表2 引物序列

引物引物序列5’末端片段引物5’GCA GCA GAA ATA TAC CAC CC3’(sense)（A/2AS）5’CCA CCC ACC TGT AGA TAG3’(antisense)3’末端片段引物 5’CAG GAG CTA TCT CCA ATC3’(sense)（4A/4AS） 5’ACA CCA AGA GGA ACA TCC3’(antisense)βactin引物 5’CTC ACA TCG TGC CCA TCT AT3’(sense)5’GAT CCT TGC GAA TAT CCA CA3’(antisense)

1.2 方法

1.2.1 RNA的抽提用Trizol抽提法提取肺组织RNA，分光光度计测定其OD值，纯净RNA的OD260/OD280比值要≥2.0。

1.2.2 RTPCR 选择cDNA上的两个位点（5’末端、3’末端）进行PCR扩增，扩增片断分别为233bp、746bp，内参βactin（扩增片断为415bp）被用来鉴定cDNA的质量。未加模板的反应管被用来作为阴性对照，以排除污染。反应体系组成：Total volume 25μl，Template RNA 3μl ，QIAGEN One Step RTPCR Enzyme Mix 1μl，5QSolution 5μl，5×QIAGEN One Step RTPCR Buffer 5μl，dNTP Mix(10mM of each dNTP) 1μl，RNasefree water 5.9μl，RNase Inhibitor(optional)0.1μl，Primers(each Primer)1μl。热循环参数：50℃逆转录30min，95℃始变性15min，30个主循环（94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min），72℃终延伸10min。

1.2.3 电泳 RTPCR产物在1.5%～2.0%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色20min，紫外灯下观察，摄像。RTPCR产物电泳后应用Scion Image 软件进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量。

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