DNAPKcs短发夹RNA载体的构建及其表达(1)-找论文网

作者：田晓予，邢辉，翁丹慧，陈刚，卢云萍，马丁

【摘要】 　　目的构建DNAPKcsshRNA表达载体，观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法将针对人DNAPKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞，RTPCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率，MTT法测定DNAPKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA 测序分析证实DNA－PKcs shRNA表达载体pSIRENDNAPKcs shRNA构建成功并在细胞中表达，转染重组载体的A2780细胞DNA－PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降；重组载体转染细胞增殖活性明显降低。结论成功构建DNA－PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA－PKcs奠定了基础；DNA－PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。

【关键词】 DNAPKcs基因；短发夹RNA；真核表达载体；细胞增殖活性

　The Construction of DNAPkcs Shorthairpin siRNA Recombinant Vector and Its Expression in Vitro

Key words：DNAPKcs; shRNA; Eukaryotic expression vector; Proliferation activity

　　DNAPKcs蛋白是DNA蛋白依赖激酶（DNAdependent Protein Kinase,DNAPK）的催化亚基，在人类的DNA双链断裂(DSBs)的主要修复途径NEHJ(nonhomologous endjoining)中发挥重要作用。本课题选择DNAPKcs编码区基因序列，与真核表达载体pSIREN构建DNAPKcs的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,在细胞内发挥RNA干扰作用，在转录后水平特异性封闭DNAPKcs基因的表达，观察该基因的抑制对卵巢癌A2780细胞增殖的影响，并为进一步研究该基因生物作用奠定实验室基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及主要试剂

卵巢癌A2780细胞株（武汉大学医学保障中心），胎牛血清（杭州四季青公司），1640培养液（Gibco BRL公司）,质粒 pSIRENDNRDsRedExpress（BD Clontech公司）, DH5α（清华天为时代），质粒小提试剂盒（北京博达泰克公司），凝胶回收试剂盒和质粒大提试剂盒（Qiagen公司）， Lipfectinamine2000脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司）， PCR反应试剂盒（Fermentas公司），Trizol试剂（Invirtogen公司），各种工具酶（Takara公司），DNAPKcs单克隆抗体（Neomarker公司），碱性磷酸酶抗鼠IgG（晶美公司），BCIP/NBT显色试剂盒（武汉凌飞科技有限公司），MTT（Sigma公司）， PCR引物及shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成，DNAPKcs shRNA表达载体的测序由大连亚法生物技术公司完成。

1.1.2 主要仪器

CO2培养箱（Hereaus公司）， PCR仪和蛋白垂直电泳系统（美国BioRad公司），酶标仪（美国Biotek公司产）。

1.2 方法

1.2.1 DNAPKcs 特异性shRNA转绿模板设计

选择人类DNAPKcs（Genebank U47077 ）cDNA两个部位作为目标序列，根据目前通用的siRNA设计原则，应用hppt:／／www.ambion.com提供的“siRNA target finder and design tool” 设计DNAPKcs 特异的19mt寡核苷酸序列加入9bp的loop环结构、U6启动子终止序列及两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，全长67bp ，以形成发卡状siRNA(shRNA)转录模板,正义链1：5’GATCCCATGGCAGGAGAGAATCAGTTCAAGAGACTGATTCTCTCCTGCCATGTTTTTTGGAAG3’反义链1：5’AATTCTTCCAAAAAACATGGCAGGAGAGAATCAGTCTCTTGAACTGATTCTCTCCTCCATGG3’正义链2: 5’GATCCCTTTATGGTGGCCATGGAGCAAGAGACTCCATGGCCACCATAAAGTTTTTTGGAAG3’反义链2:5’AATTCTTCCAAAAAACTTTATGGTGGCCATGGAGTCTCTTGAACTCCATGGCCACCATAAAGG3’。

1.2.2 DNAPKcs shRNA表达质粒的构建与鉴定

重组质粒构建与鉴定过程：(1)将备用的pSIREN载体经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分离，以凝胶纯化试剂盒纯化备用。(2)退火：分别用TE30μl溶解寡核苷酸单链，使其浓度为100μmol, 两条单链各取5μl混合，经95℃ 30s、72℃ 2min、37℃ 2min、25℃ 2min退火后备用。(3)连接：稀释上述产物至0.5μmol，按以下体系操作：将纯化的质粒片段2μl, 退火产物1μl ,10×T4DNALigase buffer1.5μl,BSA(10mg/ml)0.5μl,T4DNALigase0.5μl,H2O9.5μl,总体积15μl，室温孵育3h。(4)转化：将100μl感受态细胞放置冰上10min解冻，轻叩使其重悬，取6μl连接产物直接加入细菌悬液，轻轻混匀，冰上放置30min ，42℃水浴45s，置冰上2min，加900μl LB培养液，37℃ 250r/min,60min摇匀；取100μl菌液置于选择性固体培养基，用弯玻棒涂匀，普通培养箱37℃培养12～14h，见培养皿中长出菌落，挑取菌落3～4个分别放入2ml LB +2μl Amp、350r/min、37℃过夜，观察培养液变混浊，取500μl 菌液按照质粒小样快速提取说明书提取质粒，剩余菌液加等量甘油于－80℃保存。提取的重组质粒行双酶切鉴定，将连接成功的质粒样本根据插入片段不同命名为pSIRENDNAPKcs shRNA1和pSIRENDNAPKcs shRNA2送测序。

1.2.3 重组质粒转染A2780细胞

取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个／ml ，分别接种96、24和6孔板中，细胞融合度为50%～70％时参考脂质体转染说明书，用阳离子脂质体Lipfectinamine2000将空质粒载体pSIREN和重组质粒pSIRENDNAPKcs shRNA1、pSIRENDNAPKcs shRNA2分别转染A2780细胞,选用未转染的细胞作空白对照，96、24和6孔板终体积分别为100μl、500μl和2ml,每孔含质粒分别为0.2μg、0.8μg和4μg，每孔含脂质体分别为0.5μl、2.0μl和10μl。转染后6h更换1640完全培养液终止转染。

1.2.4 RTPCR

离心收集细胞， Trizol法提取细胞总RNA。逆转录条件：42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 10min,PCR条件：95℃ 预变性1min， 95℃ 30s、50℃ 45s、72℃ 10min、30个循环后，再72℃ 延伸10min。上游引物序列为5’TTATGCAGAAGCCCAGCT3’,下游引物序列为5’ATTATGGAGTTTACCACGAC 3’，片段长度为377bp，内参照片段扩增条件不变，其上下游引物序列分别为5’ACGGATTTGGTCGTATTGGG3’ 和5’TGATTTTGGAGGGATCTCGC3’ ，片段长度为230 bp。

1.2.5 Wester Blot法

用裂解缓冲液提取细胞总蛋白，经Bradford法定量后进行SDSPAGE电泳，上样量为80μg，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶封闭，分别加一抗DNAPKcs(1∶300 )和β－actin（1∶1000），4℃过夜， TBST洗3遍，每次15min,分别加碱性磷酸酶标记二抗（1∶500）37℃作用 1h,TBST洗3遍，BCIP/NBT显色。

1.2.6 MTT法测定细胞增殖情况

取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，种96孔板,6 000～8 000个细胞/孔，终体积100μl,细胞贴壁后，加入无血清培养液12h使细胞同步化，设未转染细胞组、空载体pSIREN组和重组质粒pSIRENDNAPKcs shRNA2组，每组设三个平行孔。分别在转染后24h、48h和72h取出一个培养板每孔加MTT（5mg/ml）10μl，培养4h，弃培养液，每孔加二甲基亚砜100μl，测波长为570nm处的吸光度值A。细胞生存率＝实验组平均A值／空白对照组A值×100％。

1.3 统计学处理

采用SPSS12.0统计软件进行χ2检验，差异显著性标准为P<0.05。

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原发性肺癌中DMBT1基因的表达

缺氧时缺氧诱导因子1α在胃癌细胞的表达及其同细胞增殖