DNAPKcs短发夹RNA载体的构建及其表达(2)-找论文网

2 结果

2.1 重组载体限制性酶切鉴定

将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后行琼脂糖凝胶电泳，见与插入片段（67bp）大小相符的条带，未酶切的相应重组质粒未见插入片段的条带，并经测序得以证实。

2.2 荧光显微镜观察转染质粒的表达

pSIRENDNAPKcs shRNA转染A2780细胞后24h、48h和72h观察被转染细胞，红色荧光蛋白表达表明重组载体转染成功，其中 48h转染效率最高，见图1。

2.3 DNAPKcsshRNA对DNAPKcs mRNA水平的抑制

提取转染后48h细胞RNA，RTPCR结果提示，转染细胞A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA1和A2780/pSlRENDNAPKcs shRNA 2组与A2780/pSIREN和A2780细胞组相比，DNAPKcs mRNA表达下降，以A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA2更明显，而A2780/pSIREN与A2780细胞相比，DNAPKcs mRNA表达没有明显变化，见图2。

1:A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA2；2:A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA1；3:A2780/pSIREN；4:A2780；5: marker

图2 A2780细胞转染pSIRENDNAPKcs shRNA后

48h DNAPKcsmRNA的表达

2.4 DNAPKcsshRNA对 DNAPKcs蛋白水平的抑制

转染细胞48h后Wester Blot提示，pSIRENDNAPKcs shRNA1和pSIRENDNAPKcs shRNA2均可明显抑制DNAPKcs蛋白的表达，以pSIRENDNAPKcs shRNA2抑制作用较强，而A2780/pSIREN无明显抑制作用，见图3。

1:A2780；2:A2780/pSIREN；3:A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA1；4:A2780/pSIRENDNAPKcs shRNA2

图3 A2780细胞转染pSIRENDNAPKcs shRNA后

48h DNAPKcs蛋白的表达

2.5 DNAPKcs表达的抑制对细胞增殖的影响

pSIRENDNAPKcs shRNA2组24h、 48h、72h和96h生存率分别为91.3％、75.0％、58.5％和54.6％， pSIREN组分别为98.9％、97.2％、90.0％和95.0％，见图4，两组生存率相比转染后24h无显著性差异（P>0.05）,转染后48h、72h和96h均有显著差异（P<0.05）。

3 讨论

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种特异性转录后基因沉默的过程。近几年来RNAi技术越来越多地应用于特异性阻断目的基因表达的研究中。在哺乳动物细胞中，RNAi由21～23个核苷酸组成的双链小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）引发，siRNA可以在体外合成或通过表达载体在细胞内合成，研究表明体内合成siRNA具有成本低、表达时间长和更接近生物体产生RNAi的自然机制等特点。Paddison等［1］选择靶基因的19～29碱记为模板合成60～75bp的双链DNA链插入质粒中，含U6启动子，转染后48h观察效应，抑制率达80%～90％。Brummelkamp等［2］研究提示，在设计插入序列时，环路结构（loop）以9个碱基效率最高，7个次之，5个几乎无功能。Spencer 等［3］按照上述原则以DNA－PKcs 基因为靶点，构建了DNA－PKcs shRNA表达载体，转染人前列腺癌细胞后48h转染效率最高达90％，96h恢复到与空载体组和未转染组相同。本实验采用带有红色荧光蛋白基因的质粒，成功构建了DNAPKcsshRNA表达载体，结果表明：在荧光显微镜下可以直接观察转染的效果，pSIRENDNAPKcs shRNA1和pSlRENDNAPKcs shRNA2成功转染A2780细胞后，经RTPCR和Westerblotting检测，在mRNA和蛋白水平均抑制了DNAPKcs的表达，但不同的目的片段设计的shRNA其抑制DNAPKcs表达的效率是不同的，高效的DNAPKcs shRNA表达载体为进一步研究DNAPKcs的功能和作用机制提供了实验基础。

在NEHJ途径中，DNAPKcs蛋白能够单独或作为多蛋白复合物的一部分，保护和连接断裂的DNA断端，是修复DSBs的主要因子，在维持端粒的稳定性和降低细胞的自吞作用等方面发挥重要作用。 Peng［4］等用DNAPKcs siRNA转染淋巴母细胞，表明DNAPKcs敲除的细胞生存曲线比未转染或模仿转染的细胞低。本实验结果也表明A2780细胞DNAPKcs表达被抑制后细胞的增殖活性是降低的。说明DNA－PKcs对于保持细胞正常的增殖活性和维持细胞遗传物质的稳定可能是至关重要的。

DNAPKcs在许多肿瘤细胞中表达是增强的，肿瘤细胞会利用DNAPK的修复能力增强使细胞对抗癌治疗产生抵抗作用，DNAPKcs被降调节后肿瘤细胞对放射线敏感性增加已得到大家的公认[5，6]。目前很多抗肿瘤药物是通过损伤肿瘤细胞DNA而发挥作用的,而肿瘤组织中DNAPK的过度表达有可能导致对化学药物的抵抗性，阿霉素获得性耐药细胞株HL60的DNAPKcs的表达较敏感细胞增高15倍，DNAPK活性增加3倍，抑制DNAPKcs表达后可部分逆转细胞的抗药性［7］；DNAPK和GST一起参与了肿瘤细胞多药耐药的形成，联合应用DNAPK的抑制剂wortmannin可使细胞对抗肿瘤药物的敏感性增加［8］；用反义核酸抑制Hele细胞DNAPKcs的表达使该细胞对顺铂的敏感性提高［9］，DNAPKcs与抗癌药物的敏感性的关系已越来越被学者们关注。

总之，DNA－PKcs可能是影响肿瘤发生发展和治疗效果的重要基因靶点，用RNA干扰这一高效的基因沉默技术靶向干预DNA修复蛋白DNA－PKcs的表达对该基因进行更深入有效的研究可能为肿瘤耐药的逆转和化疗的增敏提供新的途径。

【参考文献】
　　［1］ Paddison P J, Caudy AA, Bernstein E, et al.Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequencespecific silencing in mammalian cells[J]. Gense Dev,2002,16(8):948958.

[2] Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R, et al. System for stable expression of short interfereing RNAs in mammalian cells[J]. Science, 2002, 296(5567):550553.

[3] Spencer J Collis, Michael J, et al. Enhanced Radiation and Chemotherapymediated Cell Killing of Human Cancer Cells by Small Inhibitory RNA Silencing of DNA Repair Factors[J]. Cancer Res, 2003, 63(7): 15501554.

[4] Peng Y, Zhang Q, Nagasawa H, et al. Silencing Expression of the Catalytic Subunit of DNAdependent Protein Kinase by Small Interfering RNA Sensitizes Human Cells for Radiationinduced Chromosome Damage, Cell Killing, and Mutation[J]. Cancer Res，2002,62(22), 64006404.

[5] Anderson CW, Dunn JJ, Freimuth PI, et al.Framesshift mutation in PRKDC,the gene for DNAPKCS,in the DNA repair defective, human,glioma derived cell line M059J[J]. Radiat Res,2001, 156(1):29.

[6] Okayasu R, Suetomi K, Yu Y, et al. A deficiency in DNA repair and DNAPKcs expression in the radiosensitive BALB /c mouse[J]. Cancer Res, 2000,60(16):43424345.

[7] Shen H,Schultz M, Kruh GD, et al.Increased expression of DNA dependent protein kinse confers resistance to adriamycin[J]. Biochim Biophys Acta,1998,1381（2）:131138.

[8] Kim SH,Um JH, Dong WB, et al.Potentiation of chem.osensitivity in multidrugresistant human leukemia CEM cells by inhibition of DNAdependent protein kinase using wormannin [J].Leuk Res,2000,24(11):917925.

[9] 余子建，孙敬芬，隋见丽，等.DNAPKcs反义核酸增强Hela细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性［J］. 中国现代医学杂志，2005，15（8）：11481151.

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